Концептуализация на роли, Куриране на данни, Формален анализ, Придобиване на финансиране, Методология, Проверка, Визуализация, Писане - оригинален проект, Писане - преглед и редактиране

подобна

Отделение по хронични заболявания, метаболизъм и стареене, KU Льовен, Льовен, Белгия, Ендокринология, Университетски болници Льовен, Льовен, Белгия

Концептуализация на роли, куриране на данни, формален анализ, методология, визуализация, писане - преглед и редактиране

Партньорски отдел по хронични заболявания, метаболизъм и стареене, KU Льовен, Льовен, Белгия

Роли Куриране на данни, формален анализ, разследване, методология, писане - преглед и редактиране

Партньорски отдел по хронични заболявания, метаболизъм и стареене, KU Льовен, Льовен, Белгия

Роли Куриране на данни, разследване, методология, писане - преглед и редактиране

Партньорски отдел по хронични заболявания, метаболизъм и стареене, KU Льовен, Льовен, Белгия

Ролеви методологии, ресурси, писане - преглед и редактиране

Отделение за коремна хирургия, Университетски болници Льовен, Льовен, Белгия

Роли Куриране на данни, формален анализ, методология, ресурси, софтуер, писане - преглед и редактиране

Affiliation Département d’Anatomie Pathologique, INSERM U773, Université Paris Diderot, Париж, Франция

Разследване на роли, методология, администриране на проекти, надзор, валидиране, писане - преглед и редактиране

Партньорска лаборатория по хепатология, KU Льовен, Льовен, Белгия, Катедра по гастроентерология и хепатология, Университетски болници Льовен, Льовен, Белгия

Методология на ролите, администриране на проекти, ресурси, надзор, валидиране, писане - преглед и редактиране

Отделение за хронични заболявания, метаболизъм и стареене, KU Льовен, Льовен, Белгия, Отдел по ендокринология, Университетски болници Льовен, Льовен, Белгия

Роли Куриране на данни, формален анализ, методология, софтуер, валидиране, писане - преглед и редактиране

Партньорски отдел по хронични заболявания, метаболизъм и стареене, KU Льовен, Льовен, Белгия

Придобиване на финансиране на роли, методология, администриране на проекти, ресурси, валидиране, писане - преглед и редактиране

Отделение за хронични заболявания, метаболизъм и стареене, KU Льовен, Льовен, Белгия, Отдел по ендокринология, Университетски болници Льовен, Льовен, Белгия

Концептуализация на роли, придобиване на финансиране, методология, софтуер, надзор, валидиране, писане - преглед и редактиране

Отделение за хронични заболявания, метаболизъм и стареене, KU Льовен, Льовен, Белгия, Отдел по ендокринология, Университетски болници Льовен, Льовен, Белгия

Придобиване на финансиране на роли, методология, ресурси, надзор, писане - преглед и редактиране

Отделение за хронични заболявания, метаболизъм и стареене, KU Льовен, Льовен, Белгия, Отдел по ендокринология, Университетски болници Льовен, Льовен, Белгия

Роли Куриране на данни, методология, софтуер, надзор, писане - преглед и редактиране

Партньорски отдел по хронични заболявания, метаболизъм и стареене, KU Льовен, Льовен, Белгия

Концептуализация на роли, куриране на данни, придобиване на финансиране, методология, надзор, писане - преглед и редактиране

Отделение за хронични заболявания, метаболизъм и стареене, KU Льовен, Льовен, Белгия, Отдел по ендокринология, Университетски болници Льовен, Льовен, Белгия

  • Роман Вангойценховен,
  • Миранда ван дер Енде,
  • Катриен Корбелс,
  • Жоао Паулу Монтейро Карвальо Мори Куня,
  • Матиас Лану,
  • Пиер Бедоса,
  • Шалк ван дер Мерве,
  • Ан Мертенс,
  • Ина Джескиер,
  • Ан Мюлеманс

Фигури

Резюме

Заден план

Постигането на загуба на тегло е крайъгълният камък на лечението на метаболитните последици от затлъстяването, по-специално на глюкозната непоносимост.

Обективен

За да се определи дали подобряването на контрола на глюкозата зависи от диетичния състав на макронутриентите на диетата при идентична загуба на тегло.

Материали и методи

Двадесет и две седмични индуцирани затлъстели мишки C57BL/6 отслабнаха чрез ограничаване на калориите при нормална чау (R-NC) или диета с високо съдържание на мазнини (R-HF). Контролните мишки са били хранени с нормална чау (LEAN) или диета с високо съдържание на мазнини (OBESE). Телесното тегло и съставът бяха оценени след 8 седмици диетична интервенция. Глюкозната хомеостаза се оценява чрез интраперитонеални тестове за толерантност към глюкоза (IPGTT). Епидидимална бяла мастна (eWAT) и чернодробна тъкан са анализирани чрез имунохистохимия и RT-qPCR.

Резултати

До 30-седмична възраст телесното тегло на мишките при R-NC (31,6 ± 1,7 g, средно ± SEM) и R-HF (32,3 ± 0,9 g) е подобно на LEAN мишки (31,9 ± 1,4 g), докато OBESE мишки тежат 51,7 ± 2,4 g. Глюкозният толеранс при R-NC е по-добър, отколкото при LEAN мишки (69% AUC IPGTT, P 0,0168), докато R-HF мишките остават значително по-малко толерантни към глюкозата (125% AUC IPGTT, P 0,0279 срещу LEAN), въпреки идентичната загуба на тегло. Подложките на eWAT и размерът на адипоцитите са сходни при LEAN и R-NC мишки, докато размерът на eWAT накладката на R-HF е 180% от R-NC (P Таблица 1. Състав на макроелементите.

Прием на храна и състав на тялото

По време на 8-седмичната фаза на диетична интервенция всички мишки бяха настанени единично и претегляни седмично. Храната се доставяше веднъж седмично за групите ad libitum (LEAN, OBESE) и веднъж дневно за ограничените групи (R-NC и R-HF). Калоричният прием се измерва седмично за групите ad libitum, като се изважда теглото на останалите хранителни гранули от теглото на общата храна, доставена през тази седмица. За ограничените групи приемът на калории се изчислява като сбор от дневната доза минус евентуални остатъци от предходни дни. Средният дневен калориен прием за интервенционния период се изчислява чрез разделяне на общия прием на броя на експерименталните дни. Съставът на тялото на цялото тяло с изключване на черепа е анализиран чрез двуенергийна рентгенова абсорбциометрия (DXA; PIXImus денситометър; Lunar, Madison, WI; версия на софтуера 2.10.041) при анестезирани мишки (фенобарбитал 50 mg/kg, Sanofi Santé Animale, Брюксел, Белгия).

Непряка калориметрия

Мишките бяха настанени индивидуално в автоматизирани клетки за индиректна калориметрия (TSE Phenomaster Calocages, Бад Хомбург, Германия) в стая с температура на околната среда 22 ° C и цикъл 12 часа тъмно/светлина, както е описано [15]. Всички мишки са имали свободен достъп до вода и храна, с изключение на мишките R-NC и R-HF, при които отварянето на кошницата с храни автоматично се отваря, за да се отвори при реална консумация на храна в мишки, хранени с либит в съседните клетки. Това предотврати компенсаторния излишен прием в ограничени групи. Приемът на храна, консумацията на кислород, производството на въглероден диоксид и амбулаторната активност са регистрирани за период от 48 часа, но само последните 24 часа са използвани за изчисления, за да се изключи пристрастието на новата среда в клетката. Съотношението на дихателния обмен (RER) и производството на топлина бяха изчислени, както е описано [16].

Тестове за хомеостаза in vivo за глюкоза

Проведени са интраперитонеални тестове за глюкоза и инсулинов толеранс (IPGTT и ITT), съответно на 28 и 29 седмична възраст. След 6 часа гладуване (8:00 до 14:00), мишките се претеглят и гликемията на гладно се определя върху кръвта на вените на опашката (Accu-Chek Aviva глюкометър, Roche Diagnostics, Vilvoorde, Белгия). Приложен е глюкоза (2 g/kg телесно тегло) или инсулин (0.75 mU инсулин/g телесно тегло, Actrapid, NovoNordisk, Дания), последвано от измерване на нивата на гликемия след 15, 30, 60, 90 и 120 минути [17].

Анализ на серума и тъканите

На 30-седмична възраст се определя гликемията на опашната вена и мишките се жертват чрез обгазяване с въглероден диоксид, последвано от събиране на кръв чрез сърдечна пункция и събиране на епидидимални подложки от бяла мастна тъкан (eWAT) и черен дроб. Серумът се получава чрез центрофугиране в продължение на 10 минути при 2000 g. Нивата на инсулин се определят с помощта на търговски комплект ELISA (Mercodia, Huissen, Холандия) върху брояч на Victor Multilabel (Perkin Elmer, Wallac, Финландия). Нивата на серумна аланин минотрансфераза (ALT) се определят с помощта на биохимичен анализатор AU640 (Beckman Coulter Inc., Brea, CA). Нивата на чернодробните триглицериди (TG) бяха измервани с помощта на колориметричния анализ Triglyceride Quantification Kit (Abcam, Cambridge, UK).

Хистология и имунохистохимия

Проби от черен дроб и eWAT бяха фиксирани в параформалдехид 4% и вградени в парафин. Серийните участъци с дебелина 5 μm се оцветяват с хематоксилин и еозин (H&E), а чернодробните секции се оцветяват със Sirius Red за чернодробна фиброза. Фотомикрографиите (увеличение 20x за мастна, 10x за чернодробна тъкан) са направени на микроскоп Zeiss Axiovert с помощта на софтуера Axiovision (Zeiss, Zaventem, Белгия).

Размерът на адипоцитните клетки се определя в 3 различни микроскопични полета на мастна подложка чрез преброяване на най-малко 100 клетки с помощта на софтуера ImageJ (NIH, Bethesda, MD) с команди „анализ-зададен мащаб“, „процес – субстрактен фон“, „изображение-праг“, „Обработка на бинарни файлове“ и „Макрос за измерване и етикетиране“, както е описано [18].

Всички чернодробни проби бяха анализирани от експерт чернодробен патолог, заслепен за диетично състояние или хирургическа интервенция. Стеатозата, активността и фиброзата са полуколичествено оценени съгласно критериите на NASH-Clinical Research Network [19]. Количеството на стеатозата (процент на хепатоцитите, съдържащи капчици мазнини) е оценено като 0 (33–66%) и 3 (> 66%). Балонирането с хепатоцити е класифицирано като 0 (няма), 1 (малко) или 2 (много клетки/видно балониране). Фокусите на лобуларното възпаление са оценени като 0 (без огнища), 1 (4 огнища на 200 × поле). Фиброзата се оценява като стадий F0 (без фиброза), етап F1a (лек, зона 3, перисинусоидална фиброза), етап F1b (умерен, зона 3, перисинусоидална фиброза), етап F1c (портална/перипортална фиброза), етап F2 (перисинусоидален и портален/перипортална фиброза), етап F3 (свързваща фиброза) и етап F4 (цироза).

Количествена полимеразна верижна реакция

Общата РНК на eWAT и чернодробната тъкан се екстрахират от 50 mg тъкан, като се използва съответно RNeasy Lipid Tissue Mini Kit (Qiagen, Hilden, Германия) или SV Total RNA Isolation System (Promega, Madison, WI). СДНК от първа верига е синтезирана с помощта на Superscript II RT (Life Technologies, Гент, Белгия). qRT-PCR беше извършена с помощта на PCO система в реално време StepOne (Applied Biosystems, Гент, Белгия) и Fast SYBR Green Mastermix (Qiagen) или TaqMan mastermix (Life technologies), базирана на метода за количествено определяне ΔΔCt. Стойностите бяха нормализирани спрямо средната геометрична стойност на гените за домакинство 60S рибозомния протеин L27 и хипоксантин-гуанин фосфорибозилтрансферазата. Последователностите на грундовете са изброени в таблица S2.

Статистика

Данните са представени като средно ± SEM, освен ако не е посочено друго. Статистическите анализи бяха извършени с GraphPadPrism 6.0 (GraphPad Software, Сан Диего, Калифорния). Данните бяха сравнени чрез еднопосочен дисперсионен анализ (ANOVA), последван от post hoc анализ с тест за многократно сравнение Bonferroni, освен ако не е посочено друго във фигурните легенди. За изследване на асоциациите е извършен корелационен тест на Пиърсън. Разликите се считат за статистически значими при P Фиг. 1. Телесно тегло и телесен състав.

Еволюция на телесното тегло (а) и приема на калории (б) МИСЛИ (бели кръгове), R-NC (светлосиви нагоре триъгълници), R-HF (тъмносиви надолу триъгълници) и OBESE (черни кръгове) мишки. N = 11 за LEAN и OBESE, n = 15 за R-NC и R-HF. Телесно тегло (c) и телесен състав, изразени като процент мазнини (d) и чиста маса (e), измерени чрез DXA на 30-седмична възраст (n = 6 на група). Данните са представени като средно ± SEM * P Фиг. 2. Компоненти на енергийния разход, получени в автоматизирани клетки за индиректна калориметрия.

Скорост на дишане (a), консумация на кислород (b), производство на топлина (c) и амбулаторна активност (d) (n = 6–8 на група). Данните са представени като средно ± SEM * P2, P2 при R-NC мишки, 625 ± 39 μm2 при R-HF мишки; всички P Фиг. 3. Характеристики на епидидимална бяла мастна тъкан (eWAT) при различни интервенции за отслабване.

Относително тегло на eWAT подложки (n = 11–15 на група) (a) Размер на адипоцитите (b) въз основа на микроскопични H&E оцветени участъци от eWAT на LEAN (c), R-NC (d), R-HF (e) и OBESE (f) мишки (увеличение 20x, стълбовете на мащаба показват 100μm). Средна повърхност на адипоцити в проби от eWAT тъкан (n = 6–9 на група, G) и относителни нива на експресия на mRNA на TNF-алфа (g) и MCP-1 (h) в eWAT (n = 6–8, на група). Данните са представени като средно ± SEM. * P Фиг. 4. Характеристики на чернодробната тъкан при различни интервенции за отслабване.

Относително тегло на черния дроб (n = 11–15 на група) (a) Нива на серумна аланин аминотрансфераза (ALT) (n = 6–9 на група) (b) и съдържание на чернодробни триглицериди (TG) (n = 6 на група) (c ). H&E оцветени участъци от чернодробна тъкан от мишки LEAN (d), R-NC (e), R-HF (f) и OBESE (g) (увеличение 10x, лентите на скалата показват 200μm). Стеатоза (h), възпалителна активност (i) и фиброза (j) резултат и относителна честота на чернодробно заболяване (n = 11–15 на група) (k); Относителни нива на експресия на иРНК на TNF-алфа (n = 6-8 на група) (l). Данните са представени като средно ± SEM. * P Фигура 5. Параметри на глюкозната хомеостаза при интервенции за отслабване.

Кръвна глюкоза (n = 11–15 на група) (a) и серумни нива на инсулин (n = 6 на група) (b) след 6 часа гладуване. Тест за толерантност към интраперитонеална глюкоза и изчислена AUC (n = 8 за група) (c, d) Тест за инсулинов толеранс и изчислена AUC (n = 6 за група). Данните са представени като средно ± SEM. * P Таблица 2. Корелации между телесния състав, параметрите на глюкозата, размера на епидидималната бяла мастна тъкан (eWAT), чернодробната стеатоза и нивата на ALT.