Резюме

Заден план

Предполага се, че мастните киселини, получени от диета с високо съдържание на наситени мазнини, могат да повлияят негативно на ендотелната функция по-значително от диетата с високо съдържание на ненаситени мазнини; въпреки това ефектите от продължителното поглъщане на мононенаситени мастни киселини върху ендотелната функция са слабо проучени.

Методи

За да се изследват хроничните ефекти на мононенаситените (напр., екстра върджин зехтин (EVOO)) или наситено (напр., богата на маргарин (М) диета, богата на мастни киселини за развитието на инсулинова резистентност и ендотелна дисфункция при плъхове, три групи плъхове са хранени с контролни, високо-EVOO или високо-М диети в продължение на 20 седмици. Телесно тегло, консумация на енергия, инсулинова резистентност, липидна пероксидация и инвитро съдовата реактивност със и без метформин се оценява по време на периода на изследване.

Резултати

И двете диети с високо съдържание на мазнини произвеждат затлъстяване и инсулинова резистентност. Плъхове, хранени с EVOO, показват по-малки увеличения на общия холестерол и артериалната липидна пероксидация в сравнение с плъховете, хранени с М. Съдовата реактивност към фенилефрин и натриев нитропрусид не е модифицирана, но съдоразширяващият ефект на карбахол е особено намален при плъховете, хранени с М, в сравнение с EVOO-хранените или контролните групи. Добавянето на метформин към инкубационната среда намалява съдовия отговор към фенилефрин; намаление, което е по-ниско при плъхове, хранени с диети с високо съдържание на мазнини, и увеличава ефекта на карбахол и нитропрусид, но повишеният от метформин отговор на карбахол е по-нисък в групата М.

Заключения

Нашите резултати показват, че храненето на плъхове с големи количества EVOO, въпреки че произвежда затлъстяване и инсулинова резистентност, произвежда ниски нива на циркулиращ холестерол и артериална липопероксидация в сравнение с плъхове, хранени с М и показва запазен ендотелен отговор на карбахол, ефект, който се засилва значително само от метформин при плъхове, хранени с контролни и EVOO диети.

Заден план

Методи

Животни и диети

Реактиви

(R) - (-) - фенилефрин хидрохлорид, изопротеренол хидрохлорид, натриев нитропрусид и метформин (1.1 диметилбигуанид хидрохлорид) са закупени от Sigma и Sigma-Aldrich, а карбахолът е закупен от Research Biochemicals International. ELISA комплекти за инсулин за плъх/мишка са закупени от Millipore (Linco Research Inc., St. Charles, MO, USA).

Измервания на кръв и серум

След двадесет седмици експериментално хранене бяха взети кръвни проби от върховете на опашките на плъховете в 8:00 ч. Сутринта, след 12-часово гладуване през нощта. Нивата на глюкозата се определят в пълна кръв с глюкометър (Optium medisense, Abbott Laboratories, Оксфорд, Великобритания). Пробите (0,5 ml) бяха събрани в края на експеримента, за да се определят нивата на общия холестерол, HDL-холестерол и триглицериди (TG), използвайки специфични ензимно-колориметрични комплекти (Randox, Crumlin, UK). Пробите се центрофугират при 3500 об/мин за 15 минути при 4 ° С. Нивата на LDL-холестерол в плазмата са изчислени, използвайки формулата на Friedeward et al. [37].

Нива на кръвна глюкоза и серумен инсулин по време на интраперитонеалния тест за толерантност към глюкоза

Интраперитонеален (IP) тест за толерантност към глюкоза (GTT) беше извършен при плъхове след еднодневно гладуване от 12 часа. Проби от базална кръв бяха получени от върха на опашката и интраперитонеално се инжектира 35% разтвор на глюкоза (3 g/kg телесно тегло). На 15, 30, 60, 120 и 180 минути след прилагане на глюкозата се определят нивата на глюкоза в кръвта [38]. Проби от кръв на гладно (0,25 ml) се получават в базални условия и се центрофугират при 3500 rpm в продължение на 15 минути при 4 ° C. Полученият серум се поддържа замразен при -70 ° C, докато се определят нивата на инсулин [39]. Инсулиновата резистентност беше оценена с помощта на хомеостазния модел на оценка на инсулиновата резистентност (HOMA-IR), която се изчислява като продукт на серумния инсулин на гладно (μU/mL) и кръвната глюкоза на гладно (mg/dL), разделен на 2430 [40].

Интраабдоминални мазнини

На 20-та седмица плъховете се упояват с диетилов етер и се евтаназират чрез обезглавяване. Гръдният регион беше незабавно дисектиран и сегмент на аортата, между дъгата и диафрагмата, беше отстранен за използване при изследване на ендотелната функция. След това коремната област се дисектира и интраабдоминалните мастни натрупвания се изрязват и претеглят. Бяха взети и точно претеглени проби от аортата, черния дроб и сърцето за теста за липопероксидация.

Анализ на липидната пероксидация

Липидната пероксидация в артерията, сърцето и черния дроб се оценява чрез измерване на съдържанието на малоновия диалдехид (MDA), както е описано от Buege и Aust [41], но с незначителни модификации. Накратко, 50 mg тъкан се хомогенизира в 0,5 ml студен фосфатен буфер (рН 7,4), последвано незабавно с добавяне на 1 ml реагент, съдържащ трихлороцетна киселина, тиобарбитурова киселина и HCl [15% (w/v), 0,375% (w/v) и 0.25 N, съответно] към хомогената. След това този разтвор се нагрява в продължение на 60 минути във вряща водна баня. След охлаждане, флокулентната утайка се отстранява чрез центрофугиране при 1000 g за 10 минути. Използва се спектрофотометър за определяне на абсорбцията при 532 nm. Като заготовка се използва само проба, съдържаща реагент. Съдържанието на MDA се изчислява, като се използва коефициент на екстинкция от 1,56 × 10 -5 M -1 cm -1. Съдържанието на протеин се определя по метода на Coomassie blue [42], като говежди серумен албумин като стандарт.

Измерване на изометрична сила

Сегментът на гръдната аорта се поставя в кислороден, модифициран разтвор на Krebs-Hanseleit (KHS) (NaCl, KCl, NaHCO3, CaCl2, NaHPO4, MgSO4, декстроза и EDTA). Гръдната аорта е почистена от слабо прилепнали мазнини и съединителна тъкан. Той се нарязва на пръстени с широчина 3 mm и след това се поставя в кислородна (95% O2, 5% CO2) баня с 10 ml KHS, като единият край на образеца е свързан с държач на тъкан, а другият с преобразувател ( TSD125C-50 g, BIOPAC Systems Inc. Санта Барбара, Калифорния, модел MP100). Първо, аортният пръстен се уравновесява за 45 минути при напрежение в покой от 2,0 g. След уравновесяване, аортните пръстени бяха предварително контрактирани с фенилефрин (1 × 10 -6 М) и след достигане на стабилна фаза на платото бяха изложени на карбахол (1 × 10 -6 М), за да се провери функционалността на ендотела. Контракцията се предизвиква отново с фенилефрин (1 × 10 -6 М), след което кумулативните криви на концентрация-отговор към натриев нитропрусид или карбахол се определят от 1 × 10 -8 до 1 × 10 -4 М за релаксационните изследвания. В друг набор от експерименти са генерирани кумулативни криви на концентрация-отговор към фенилефрин (1 × 10 -8 до 1 × 10 -4 М).

Метформин е широко използван за повишаване на глюкозния и липидния метаболизъм при пациенти и модели на гризачи със захарен диабет тип 2 и инсулинова резистентност за подобряване на гликемичния контрол и понижаване на кръвното налягане. Въпреки това, механизмите на инсулинова резистентност за увеличаване на честотата на съдови заболявания не са напълно изяснени [43]. Освен това, тъй като се съобщава, че метформинът отпуска изолирани артериални препарати чрез механизъм, зависим от азотен оксид [43], предположихме, че добавянето на метформин към инкубационната среда трябва да подобри реакцията към съдовите активни вещества, показвайки диференциални ефекти по отношение на диетичния състав на мазнините . По този начин, след извършване на предишните експерименти, сегментите на аортния пръстен бяха измити достатъчно, за да възстановят своята базална контракция (2,0 g) и бяха инкубирани в метформин (10 -4 М) в продължение на 40 минути, накрая, първият експеримент беше повторен, като се използва същата инкубация средно.

статистически анализи

Резултатите са представени като средни стойности ± SEM и са използвани еднопосочни ANOVA, двупосочни RM-ANOVA или трипосочни RM-ANOVA анализи за сравняване на средните стойности между различните групи, последвани от допълнителен анализ с Student- Нюман – Кийлс post hoc тест. Във всички случаи P стойност от 0,05 или по-малко (двустранна) се счита за статистически значима.

Резултати

Консумация на храна, енергиен прием и телесно тегло

Плъховете, хранени с екстра върджин зехтин и маргарин, приемат значително по-малко храна от контролните диетични плъхове P Фигура 1

диета

Гликемия и глюкозен толеранс

На 20-та седмица от диетичното лечение, IP инжекция на глюкозен разтвор (3 g/kg) води до значително увеличение на гликемията след 15 минути при всички животни. След 30 минути нивата на кръвната захар намаляват само при контролните плъхове и са значително по-ниски при тези плъхове в сравнение с HF-хранените плъхове. На 180 минути контролната диетична група се е възстановила до изходните си нива на глюкоза в кръвта, но групите с HF-диета не (Фигура 2А). Площта под кривата на глюкозата е значително по-голяма в групите с HF-диета, отколкото в контролната група (Фигура 2В). Съответните нива на инсулин при гладуване обаче не се различават между групите. HOMA-IR анализът разкрива значителни разлики в инсулиновата резистентност между групите с HF диета и контролната група (Таблица 2).

Общ серумен холестерол, липопротеинов холестерол (HDL и LDL) и триглицериди (TG)

Общият холестерол, HDL, LDL и TG плазмени концентрации след 20-седмично диетично лечение варират между експерименталните групи. Плъховете, хранени с М, показват по-високи плазмени нива на общ и LDL-холестерол от тези, установени при контролните или EVOO-хранени плъхове (P Таблица 3 Общ серумен холестерол, HDL, LDL и TG концентрации и интраабдоминална мастна тъкан

Интраабдоминални мазнини

Комбинираното тегло на ретроперитонеалните, епидидималните и мезентериалните мастни накладки, изразено като процент от телесното тегло, е било по-голямо при плъховете с HF-диета, отколкото при контролните плъхове (Таблица 3).

Липидна пероксидация

Нивата на малондиалдехид в гръдните аорти, сърцата и черния дроб на групата с М-диета са значително по-високи от нивата, открити в контролната или EVOO групата (Р Таблица 4 Нива на малондиалдехид в аортата, сърцето и черния дроб

Инвитро аортен отговор на фенилефрин при липса и наличие на метформин

При генерирането на кривите на концентрация-отговор за фенилефрин не са открити значителни разлики между диетичните групи (P> 0,05) (Фигура 3А). Инкубацията на аортните пръстени обаче с метформин (10 -4 М) значително намалява вазоконстрикторния отговор (Р Фигура 3

Реакция на релаксация към карбахол или натриев нитропрусид при липса или присъствие на метформин

Добавянето на фенилефрин (1 × 10 -6 М) към инкубиращата среда предизвиква максимална контракция, която достига плато. Впоследствие се определя кривата на концентрация-отговор за натриев нитропрусид за всяка група (1 × 10 -8 до 1 × 10 -4 М), както в присъствието, така и в отсъствието на метформин. Релаксиращият ефект на карбахола е значително по-нисък при плъховете, хранени с М, в сравнение с EVOO-хранените или контролните групи (Фигура 3С). Метформин увеличава релаксацията, произведена от карбахол във всички диетични групи, но ефектът на метформин е по-слабо изразен в групата, хранена с М (Фигура 3D). Няма значителни разлики в релаксационния отговор на натриев нитропрусид на експерименталните групи, както в присъствието, така и в отсъствието на метформин (P> 0,05), но има значителна разлика във всяка група в отговорите им на натриев нитропрусид преди и след добавяне на метформин към инкубационната среда (Фигура 3Е и 3F).

Дискусия

Заключения

В заключение установихме, че дългосрочният прием на високо съдържание на мазнини води до затлъстяване и инсулинова резистентност, независимо от състава на мазнините (наситени или мононенаситени). Независимо от това, EVOO не повишава плазмените нива на общия холестерол или LDL холестерола, нито увеличава пероксидацията на артериалните липиди, което може да допринесе за запазването на ендотелната реакция към карбахол, ефект, който се засилва значително от метформин само при плъхове, хранени с контрол и EVOO диети. В допълнение към това предварително проучване, по-дългосрочни животни и инвитро са необходими проучвания за по-добро разбиране на механизмите по отношение на поглъщането на диета с високо съдържание на екстра върджин зехтин, за да се получи затлъстяване и инсулинова резистентност, но да се защити ендотелната функция.