Партньори Испански център за биомедицински изследвания в областта на диабета и свързаните с него метаболитни разстройства (CIBERDEM), Мадрид, Испания, Институт за разследване на болница Санитариа дел Клиника Сан Карлос (IdISSC), Мадрид, Испания

идентифициране

Афилиация Instituto de Investigación Sanitaria del Hospital Clínico San Carlos (IdISSC), Мадрид, Испания

Партньори Испански център за биомедицински изследвания в областта на диабета и свързаните с него метаболитни разстройства (CIBERDEM), Мадрид, Испания, Институт за разследване на болница Санитариа дел Клиника Сан Карлос (IdISSC), Мадрид, Испания

Партньори Испански център за биомедицински изследвания в областта на диабета и свързаните с него метаболитни разстройства (CIBERDEM), Мадрид, Испания, Институт за разследване на болница Санитариа дел Клиника Сан Карлос (IdISSC), Мадрид, Испания

Афилиации Испански център за биомедицински изследвания в областта на диабета и свързаните с него метаболитни нарушения (CIBERDEM), Мадрид, Испания, Instituto de Investigación Sanitaria del Hospital Clínico San Carlos (IdISSC), Мадрид, Испания

Партньори Испански център за биомедицински изследвания в областта на диабета и свързаните с него метаболитни разстройства (CIBERDEM), Мадрид, Испания, Институт за разследване на болница Санитариа дел Клиника Сан Карлос (IdISSC), Мадрид, Испания

  • Нурия Пескадор,
  • Милагрос Перес-Барба,
  • Хосе Мария Ибара,
  • Артуро Корбатон,
  • Мария Тереза ​​Мартинес-Ларад,
  • Мануел Серано-Риос

Фигури

Резюме

Предистория и цел

МикроРНК са малки некодиращи РНК, които играят важни регулаторни роли в различни биологични процеси, включително сложни метаболитни процеси, като енергиен и липиден метаболизъм, които са изследвани в контекста на диабета и затлъстяването. Наскоро беше доказано, че някои специфични микроРНК съществуват в стабилен и стабилен аспект в серума и потенциално са специфични за заболяването. Целта на това проучване за профилиране е да се характеризира експресията на miRNA в серумни проби на индивиди със затлъстяване, недиабетно заболяване и диабетици със затлъстяване, за да се определи дали експресията на miRNA е била дерегулирана в тези серумни проби и да се установи дали някаква наблюдавана дерегулация е специфична или за затлъстяването, или за диабета или затлъстяване с диабет.

Пациенти и методи

За това проучване са избрани 13 пациенти с диабет тип 2, 20 пациенти със затлъстяване, 16 пациенти със затлъстяване с диабет тип 2 и 20 здрави контроли. MiRNA PCR панели бяха използвани за скрининг на серумни нива от 739 miRNAs в обединени проби от тези четири групи. Сравнихме нивата на циркулиращи miRNAs между серумни пулове от всяка група. Индивидуално валидиране на дванадесетте микроРНК, избрани като обещаващи биомаркери, беше проведено с помощта на RT-qPCR.

Резултати

Установено е, че три серумни микроРНК, miR-138, miR-15b и miR-376a, имат потенциал като предсказващи биомаркери при затлъстяване. Използването на miR-138 или miR-376a предоставя мощен инструмент за предсказване за разграничаване на пациентите със затлъстяване от нормалните здрави контроли, пациенти с диабет и пациенти със затлъстяване. В допълнение, комбинацията от miR-503 и miR-138 може да разграничи диабетиците от пациентите със затлъстяване.

Заключение

Това проучване е първото, което показва панел от серумни miRNAs за затлъстяване и ги сравнява с miRNAs, идентифицирани в серума за диабет и затлъстяване с диабет. Нашите резултати подкрепят използването на някои miRNAs, извлечени от серумни проби като потенциални инструменти за предсказване при затлъстяване и диабет тип 2.

Цитат: Pescador N, Pérez-Barba M, Ibarra JM, Corbatón A, Martínez-Larrad MT, Serrano-Ríos M (2013) Серумно циркулиращо микроРНК профилиране за идентифициране на потенциални биомаркери за диабет тип 2 и затлъстяване. PLoS ONE 8 (10): e77251. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0077251

Редактор: Qingyang Huang, Централен Китайски нормален университет, Китай

Получено: 2 юни 2013 г .; Прието: 9 септември 2013 г .; Публикувано: 15 октомври 2013 г.

Финансиране: Тази работа е финансирана от CIBER в областта на диабета и свързаните с него метаболитни нарушения (ISCIII, Ministerio de Ciencia e Innovación) и Мадридска автономна общност (MOIR S2010/BMD-2423). Частична подкрепа дойде и от образователни грантове от Eli Lilly Lab, Испания. Финансистите не са играли роля в дизайна на проучването, събирането и анализа на данни, решението за публикуване или подготовката на ръкописа.

Конкуриращи се интереси: Авторите имат следните интереси: тази работа е частично финансирана от търговски източник (Eli Lilly Lab). Това не променя придържането на авторите към всички политики PLOS ONE за споделяне на данни и материали.

Въведение

Целта на това проучване за профилиране е да се характеризира експресията на miRNA в серумни проби на индивиди със затлъстяване, без диабет със затлъстяване и затлъстяване. Искахме да определим дали експресията на miRNA е била дерегулирана в тези серумни проби и да идентифицираме дали някоя наблюдавана дерегулация е специфична или за затлъстяване или диабет, или затлъстяване с диабет. Това проучване е първото, което показва панелна серумна miRNA за затлъстяване и ги сравнява с miRNAs, идентифицирани в серума за диабет и затлъстяване с диабет.

Материали и методи

Проучване на популация, събиране на кръв и подготовка на серум за miRNA изследвания

Контроли DM2OBOB-DM2
№ Субекти M/F%20; 50/5013; 53/4620; 15/8516; 60/40
Възраст (години)42,9 ± 12,1369,40 ± 7,12 *41,7 ± 11,1867,55 ± 11 *
ИТМ (Kg/m 2)22,7 ± 2,4324,86 ± 1,4942,73 ± 4,67 *33,38 ± 2,86 *
Периметър на талията (см)79,45 ± 7,7791,53 ± 6,75110,56 ± 10,26 *121,13 ± 7,26 *
Глюкоза на гладно (mg/dl)91,27 ± 7,25126,57 ± 23,09 *93,32 ± 6,25148,45 ± 60,16 *
Инсулин10,14 ± 5,5621,25 ± 12,65 *29,24 ± 13,2 *29,78 ± 20,93 *
HOMA2,38 ± 1,466,89 ± 5,816,22 ± 2,9910,64 ± 8,66
Холестерол (mg/dl)185,8 ± 31,88183,47 ± 38,38197,33 ± 35,52180,79 ± 37,2
LDL-C (mg/dl)108,77 ± 24,5984,22 ± 26,97 *118,13 ± 29,9571,86 ± 33,49 *
HDL-C (mg/dl)61,85 ± 17,555,60 ± 10,949,13 ± 11,65 *50,16 ± 7,87 *
SBP (mmHg)111,8 ± 12,63131 ± 17137 ± 14131 ± 16
DBP (mmHg)71,5 ± 10,0175 ± 1077 ± 9,683 ± 12
Обиколки на талията (см)79,45 ± 7,7791,53 ± 6,75110,56 ± 10,26 *121,13 ± 7,26 *

Таблица 1. Клинични характеристики.

miRNA изолация и контрол на качеството на РНК

Анализ на отделни miRNAs чрез количествена PCR в реално време

Използвахме miRCURY LNA ™ microRNA PCR система (Exiqon) за оценка на присъствието в серума на отделни miRNAs. CDNA беше използвана като шаблон за qPCR реакция, използвайки miRNA специфичен LNA ™ PCR праймер и Universal PCR праймер. Количествата на генната експресия са количествено използвани 7900HT PCR в реално време PCR система (Applied Biosystems Inc.) в плаки с 384 ямки. За анализа чрез qRT-PCR във всяка разширена проба първо оценихме подходящ брой референтни miRNAs, въз основа на повишена стабилност на експресията и използвайки методологията GeNorm. Анализът GeNorm предлага включване на 4 референтни miRNAs (miR-30C, miR-103, miR-191 и miR-423-3p). Изборът и добавянето на различни ендогенни контроли (референтни miRNAs) за измерване чрез qRT-PCR и използването на тази геометрична средна стойност са определени като сред най-точните и стабилни фактори за нормализиране [15]. По този начин средно геометричната стойност на всички избрани вътрешни контроли се използва като нормализиращ фактор. Относителният израз се изчислява, използвайки сравнителния Ct метод.

Статистически анализ

Статистическият анализ беше извършен с версията на софтуера SPSS 15,0 (SPSS, Inc., Чикаго, САЩ). P-стойност -ΔΔCt беше най-малко 5.

Валидиране чрез RT-qPCR в отделни серумни проби

За потвърждаване на потенциалните биомаркери, идентифицирани от резултатите от предварителния скрининг, серумните нива на тези miRNAs бяха измерени чрез qRT-PCR анализи. Както е описано по-горе в Материали и методи, геометричната средна стойност на всички избрани вътрешни контроли (miR-30C, miR-103, miR-191 и miR-423-3p) е използвана като контрол за нормализиране в серума. Серумните нива miR-30C, miR-103, miR-191 и miR-423-3p са оценени при всички пациенти (пациенти и контролни групи). Нашите данни показват, че не се наблюдава значителна разлика в термина на стойностите на Ct на тези miRNAs между контролни и проби от пациент (Таблица S4). Серумните нива на 12-те избрани miRNAs бяха потвърдени чрез qRT-PCR върху 69 серумни проби (Фигура S2; Таблица S5). Нашите данни показват, че всички 12 miRNAs са открити в серум, но само miR-138 и miR-376a в затлъстелия серум са значително намалени и нивото на miR-15b в серума е значително по-високо в сравнение с контролите, диабетици и затлъстели диабетици (всички p-стойности Фигура 1. Сравнение на серумните нива на miR-138 (A), miR-376a (B), miR-15b (C) и miR-503 (D) в контроли, DM2, OB и OB-DM2 групи.

Графиките показват средно ниво с интерквартилен обхват. Тестът на Крускал-Уолис с пост-теста на Дън е използван за определяне на значимостта на разликите между групите. Серумните нива бяха определени с помощта на RT-PCR след екстракция на РНК. Бяха проведени две технически повторения на две cDNA повторения.

Оценка на потенциала на биомаркер на miR-138, miR-376a и miR-15b, за да се разграничат пациентите с ОВ от нормалния здрав контрол

Анализите на кривата на работната характеристика на приемника (ROC) показват, че зоните на ROC крива само за miR-138, miR-376a и miR-15b са 0,9950 (95% CI, 0,98310-1,0000), 0,8875 (95% CI, 0,78905-0,98595) и 0.9075 (95% CI, 0.6543-0.9404) съответно (Фигура 2А, 2В, 2С). Въпреки че miR-15b и miR-376a сами генерират задоволителни ROC стойности, miR-138 (Фигура 2А) показва ROC стойности за дискриминиране на пациентите с OB от здрав контрол. Следователно, използването само на miR-138 осигурява отлична дискриминация между пациентите с ОВ и здравите субекти.

(A) miR-138, (Б.) miR-376a и (° С) miR-15b може да прави разлика между OB и CTR. (д) miR-138 (Е.) miR-376a (F) miR-15b може също да прави разлика между OB и OB-DM2. (G) miR-138 (З.) miR-376a (Аз) miR-15b може да прави разлика между OB и DM2.

Оценка на потенциала на биомаркер на miR-138, miR-376a и miR-15b, за да се разграничат пациентите с OB от пациентите с OB-DM2 и DM2

За да определим дали нивата на серумни miRNAs могат да бъдат използвани за разграничаване на пациентите със затлъстяване от пациентите с OB-DM2 и DM2, установихме ROC криви, за да анализираме разликата в нивата на серумни miR-138, miR-376a и miR-15b между групите. Сравнявайки OB пациентите с OB-DM2, ROC криви области на miR-138, miR-376a и miR-15b се установиха на 0.8758 (95% CI: 0.6838-0.9477), 0.8816 (95% CI, 0.7797-0.9835) и 0.7974 (95% CI, 0.6543-0.9404) съответно (Фигура 2D, 2E, 2F). Тези резултати ясно показаха, че нивата на серумни miR-138 и miR-376a могат да разграничат пациентите с OB от OB-DM2. След това сравнихме нивата на тези серумни miRNAs между OB и DM2. Областите на ROC крива на miR-138, miR-376a и miR-15b бяха, 0.8538 (95% CI: 0.7165-0.0.9912), 0.8423 (95% CI, 0.7065-0.9781) и 0.8769 (95% CI, 0.7546-0.9992 ) (Фигура 2G, 2H, 2I). Тези резултати също демонстрират, че нивата на тези три miRNAs могат да разграничат пациентите с OB от DM2. Заедно тези резултати демонстрират, че нивата на miR-15b, miR-138 и miR-376a в серума могат да се използват за разграничаване на OB от OB-DM2, DM2 и здравословен контрол.

Оценка на потенциала на биомаркер на miR-503 и miR-138 в комбинация за разграничаване на DM2 от OB-DM2 пациенти

Нашите резултати показват, че единичната miRNA не може да прави разлика между DM2 и OB-DM2 (Фигура 1). miR-503 беше само един, който позволява разграничаване между DM2 или OB-DM2 от здрави контроли (Фигура 1D). При множествен логистичен регресионен анализ на miR-503 и miR-138 получената ROC крива показва разумно разделяне между двете групи (AUC = 0,7773; CI 0,5886-0,9661) (Фигура 3А). Множественият логистичен регресионен анализ на miR-503 и miR-376a също е в състояние да направи разграничение (AUC = 0,7530; CI 0,5596-0,9465) (Фигура 3В). Този анализ на miR-503 и miR-15b обаче не може да разграничи тези условия (Фигура 3С). Важно е биомаркерите на miRNA да могат да различават пациенти със затлъстяване и диабет от пациенти със затлъстяване или здрави контроли. Такъв тест би бил полезен за подпомагане при прогнозирането на диабет.

Комбинацията от miR-503 и miR-138 (A) и miR-503 и miR-376a (Б.) биха могли да разграничат DM2 от пациентите с OB-DM2. (° С) Комбинацията от miR-503 и miR-15b не може да прави разлика между пациенти с DM2 и OB-DM2.

Дискусия

Няма обаче съобщения за ролята на miR-376a при затлъстяването. В хепатоцелуларните карциномни клетки HCC, miR-376a се регулира значително надолу и повишената miRNA-376a потиска клетъчната пролиферация и индуцира апоптоза в HCC клетки чрез насочване към p85α и директно намаляване на PIK3R1 [31]. Апоптозата е основен механизъм за поддържане на хомеостазата чрез премахване на опасни и ненужни клетки. Адипоцитите обаче са устойчиви на апоптоза поради високите нива на Akt/протеин киназа В и антиапоптотичния фактор Bcl-2. Адипоцитите могат да бъдат отстранени чрез апоптотични механизми при някои патологични състояния като затлъстяване. Индукцията на апоптоза в адипоцитите чрез регулиране на miR-376a може да бъде възможен метод за намаляване на броя на адипоцитите.

Следователно, тези три miRNA, идентифицирани в това проучване, могат да бъдат замесени в адипогенезата, регенерацията на панкреаса, пролиферацията и апоптозата. Всички тези процеси са важни в среда на затлъстяване, но нашите резултати показват, че тези miRNA представляват значителни разлики между OB и здравословен контрол и, което е по-важно, тези miRNAs позволяват да се прави разлика между пациентите с OB и OB-DM2. Прогресията до явен диабет при затлъстели не винаги е предсказуема. По този начин, докато някои хора със затлъстяване прогресират до диабет тип 2, други може да имат само леки метаболитни аномалии, което предполага, че абсолютното количество натрупани мазнини може да не е най-важният фактор, определящ връзката между затлъстяването и диабета тип 2 [32]. Всъщност други фактори като възпаление на мастната тъкан се разглеждат като ключови стимулатори на прогресията към диабет тип 2 [33]. Наскоро беше съобщено, че miR-138 е регулиран надолу при плоскоклетъчен карцином на хранопровода (ESCC) и маркерите на липидните плотове FLOT1, FLOT2 и кавеолин-1 бяха идентифицирани като негови мишени, а NF-kappaB беше активиран [34]. Ще бъдат необходими бъдещи проучвания, за да се изследва дали понижаването на miR-138 в серумни проби на пациенти със затлъстяване може също да играе важна роля в процеса на възпаление на затлъстяването.

В това проучване е идентифициран серумен 3-miRNA-базиран профил на експресия, който е в състояние да разпознае точно индивидите с OB от нормални контроли и пациенти с OB-DM2 и DM2. Въпреки това, някои от силно изразените miRNAs са различни от тези, открити в предишни проучвания. Това несъответствие може да се дължи главно на разликите в източниците на miRNA или на разликата между вътреклетъчните miRNAs и извънклетъчните miPHK. Други фактори, като дизайн на изследването, раса, размер на извадката или методология, също може да са повлияли на крайните резултати. Тези констатации могат да имат последици в разбирането на ОВ, установяване на стратегии за управление и оценка на прогнозата.

Възниква важен въпрос относно потенциалното въздействие на фармакологичното лечение, използвано при диабет, затлъстяване и свързаните с него състояния, върху която и да е от идентифицираните miRNAs. На практика няма проучвания, които да разглеждат този проблем в клинични условия. Само Zampetaki et al. [8] показа сходни нива на 13 miRNAs в плазмата (miR-15a, miR-20b, miR-21, miR-24, miR-126, miR-191, miR-197, miR-223, miR-28-3p, miR-150, miR-29b, miR-320 и miR-486) ​​на пациенти с диабет със или без медикаментозно лечение, главно сулфонилурейни продукти. Всъщност се препоръчват проучвания за оценка на ролята на лекарствата за регулиране на miRNA при метаболитни нарушения.

В заключение: Това проучване е първото, което показва панел от серумни miRNAs за затлъстяване и ги сравнява с miRNAs, идентифицирани в серума за диабет и затлъстяване с диабет. Освен това, нашето проучване подкрепя използването на miR-15b, miR-138 и miR-376a, извлечени от серумни проби като потенциални предсказващи инструменти за затлъстяване и диабет тип 2.