Редактирано от Джордж Е. Сейдел-младши, Държавен университет в Колорадо, Форт Колинс, Колорадо, и одобрено на 13 май 2005 г. (получено за преглед на 1 март 2005 г.)

диетата

Резюме

Въпреки че яйчниковият естроген, естрадиол-17β, е ключов модулатор на нормалните репродуктивни функции, естествените и синтетични съединения с подобни на естроген дейности могат допълнително да повлияят на репродуктивните функции. Фитоестрогените, получени от растения, специално са получили много внимание поради свързаните ползи за здравето. Въпреки това, цялостното разбиране на полезните и/или вредните въздействия на консумацията на фитоестроген чрез търговски диети за гризачи върху биологията на матката и ранната бременност на молекулярно ниво остава до голяма степен неизследвано. Използвайки множество подходи, тук демонстрираме, че излагането на възрастни женски мишки на търговска диета с гризачи с по-високи нива на фитоестроген улеснява растежа на матката в присъствието или отсъствието на яйчников естроген, променя експресията на матката на гени, реагиращи на естроген, и подобрява времето за имплантиране в сравнение с диета с по-ниски нива на фитоестроген. Констатацията, че вариабилността в съдържанието на фитоестроген в диетите за гризачи, както в рамките на, така и между марките, влияе върху експерименталните резултати, подчертава значението на това разследване и повишава предпазливостта на изследователите, използващи гризачи като животински модели.

Много естествени и синтетични съединения имитират естроген и влияят на функциите на матката, като взаимодействат с ядрени естрогенни рецептори или други сигнални молекули (6–8). Тези естрогенни съединения включват предимно ксеноестрогени в околната среда и диетични фитоестрогени. По-рано показахме, че ксеноестрогените индуцират подобен на естроген ранен фазов отговор (6, 9, 10) и регулират експресията на естроген-реагиращи гени в матката (6, 7). По-важното е, че ксеноестрогените индуцират имплантация при P4-грундирани плъхове при липса на яйчников естроген (9, 10). Тези наблюдения показват, че ксеноестрогените могат да повлияят на функциите на матката. Наскоро растителните нестероидни фитоестрогени получиха внимание, тъй като се счита, че имат много ползи за здравето (11). Естрогенните съединения обаче действат и като ендокринни разрушители, причинявайки нарушения в развитието и репродукцията (12). Поради това е важно внимателно да се оценят полезните ефекти на диетичните естрогени спрямо техните потенциални вредни ефекти в естроген-реагиращите целеви тъкани.

Понастоящем повечето търговски лабораторни диети за гризачи са формулирани със соя и люцерна (13, 14), като доставят значителни дневни дози изофлавони на животните през целия им живот. Последните проучвания показват, че гризачите, консумиращи тези търговски диети ad libitum, имат високи стационарни нива на изофлавони в циркулацията си, надвишаващи ендогенните нива на естроген с 30 000 до 60 000 пъти (15), въпреки че тези нива в циркулация представляват както свободни (биоактивни) гликозилирани изофлавони. Освен това има доказателства, че генистеинът, един от изофлавоните, има значителен достъп и ефективни свободни фракции в серумите в сравнение с естествения естрадиол-17β (Е2) (16). По този начин се подозира, че високите хранителни нива на фитоестроген ще повлияят на действието на естествения естроген в матката.

Материали и методи

Животни и диети. Мишките бяха настанени в съответствие с Институционалния комитет за грижи и употреба на животните и насоките на Националните здравни институти. Шестседмични женски мишки CD1, закупени от развъдните лаборатории на Чарлз Ривър, бяха настанени с цикъл светлина: тъмнина от 12 часа: 12 часа. Мишките бяха разпределени на случаен принцип в две групи и хранени с търговските диети за гризачи Purina 5V00 или 5001, които съдържат подобни диетични съставки, но с различни нива на изофлавони (www.labdiet.com/indexlabdiethome.htm). Диетата Purina 5V00 съдържа общо 400 ppm изофлавони (13, 15). Храна и вода се предоставят ad libitum на всички мишки. Ако приемем дневна консумация от 4 g гранулирана дажба на възрастна мишка, дневно се консумират 200 и 1600 μg от общите изофлавони от диетите 5V00 и 5001, съответно. Обикновено мишките от Vanderbilt се поддържат на диетата Purina 5001.

Утеротрофни и клетъчно-пролиферативни анализи. Мишките бяха на диета Purina 5V00 или 5001 в продължение на 6 седмици. След това бяха овариектомизирани и разделени на случаен принцип в няколко групи. След още 2 седмици консумация на съответните диети, на мишките се инжектира s.c. със сусамово масло (0,1 ml на мишка), P4 (2 mg на мишка), естрадиол-17β (E2; 100 ng на мишка) или комбинация от същите дози P4 и E2. Контролната група от мишки не получи лечение. Мишките бяха убити на 6 и 24 часа след лечение със стероиди и беше записано телесно тегло. Разтворът BrdUrd (40 mg на kg телесно тегло; Zymed) е i.p. инжектира се 2 часа преди жертвата. Маточните рога бяха разрязани, без прилепнали мазнини и мезентерии. След претеглянето, един маточен рог беше фиксиран в 10% буфериран формалин за имунооцветяване, а контралатералният рог беше замразен за миг за генен анализ. Отговорът на растежа на матката по отношение на влажното тегло на матката и съотношението на теглото на матката към телесното тегло беше анализиран чрез t тест, последван от анализ на дисперсията и анализ на ковариацията със spss софтуер (SPSS, Чикаго).

Имплантация „Прозорец“ и забавено имплантиране. Мишките бяха хранени с диета Purina 5V00 или 5001 в продължение на 8 седмици. За да се предизвика бременност, жените се поставят за една нощ с плодородни мъже и се проверяват за вагинални тапи на следващата сутрин (вагинална запушалка = ден 1). За да се проучат ефектите от диетата върху момента на имплантацията, бременни жени са били убити през 2000, 2200 или 2400 часа на ден 4 вечерта и броят на местата за имплантиране, обозначени със сини ленти, е бил записан след i.v. инжекции на разтвор на багрило от чикагско синьо B (20). За да се потвърди бременността, матките, лишени от какъвто и да е признак на имплантация, се промиват, за да се възстановят неимплантирани бластоцисти. За да се изследват ефектите на диетичните фитоестрогени върху подготовката на матката за имплантиране, е използван модел на забавено имплантиране. Това състояние се индуцира чрез овариектомизиране на бременни мишки на ден 4 сутринта (0830 до 0900 часа) и се поддържа чрез ежедневни инжекции с Р4 (2 mg на мишка) от ден 5 до ден 7. дози Е2 (1,5, 3,0 или 10 ng на мишка) на ден 7. Мишките бяха умъртвени 24 часа по-късно и броят на местата за имплантиране беше записан по метода на синьото багрило.

Имунохистохимия. Клетъчната пролиферация във фиксирани с формалин, вградени в парафин участъци (5 μm) беше открита с помощта на комплект за оцветяване на Zymed BrdUrd. Имунолокализацията на прогестеронов рецептор (PR) и естрогенен рецептор-α (ERα) се извършва чрез използване на моноклонално миши анти-PR антитяло (Zymed) и поликлонално заешко анти-ERα антитяло (Santa Cruz Biotechnology), съответно. За визуализиране на антигена се използва комплект Histostain-Plus (DAB) (Zymed). Червеникавокафявите отлагания показват места на положително имунооцветяване.

In Situ Хибридизация. In situ хибридизацията се извършва в замразени участъци (10 μm), както е описано по-рано от нас (21).

RT-PCR. Екстракцията на РНК, RT и сравнителните PCR реакции (25 цикъла) са описани по-рано от нас (22). Изобилието на LF (лактоферин), LIF (левкемичен инхибиторен фактор), PR (ядрен прогестеронов рецептор), ERα (ядрен естрогенен рецептор α) и sFRP2 (секретиран заплетен свързан протеин 2) иРНК се коригира спрямо rPL7.