Карина Грубер

1 Институт по анатомия и клетъчна биология, Justus-Liebig-University Giessen, Aulweg, Giessen, Германия

реконструкция

Надин Нинк

1 Институт по анатомия и клетъчна биология, Justus-Liebig-University Giessen, Aulweg, Giessen, Германия

Сандийп Никам

2 Отдел за развитие и ремоделиране на белите дробове, Макс-Планк-Институт за изследване на сърцето и белите дробове, Паркщрасе, Бад Наухайм, Германия

Герд Магдовски

1 Институт по анатомия и клетъчна биология, Justus-Liebig-University Giessen, Aulweg, Giessen, Германия

Герхард Крип

1 Институт по анатомия и клетъчна биология, Justus-Liebig-University Giessen, Aulweg, Giessen, Германия

Робърт Восвинкел

2 Отдел за развитие и ремоделиране на белите дробове, Макс-Планк-Институт за изследване на сърцето и белите дробове, Паркщрасе, Бад Наухайм, Германия

Кристиан Мюлфелд

1 Институт по анатомия и клетъчна биология, Justus-Liebig-University Giessen, Aulweg, Giessen, Германия

3 Институт по функционална и приложна анатомия, Медицинско училище в Хановер, Хановер, Германия

Резюме

Въведение

Сърдечната атрофия възниква в резултат на продължителна почивка в леглото, механично разтоварване или по време на периоди на катаболизъм, като ракова кахексия или недохранване (Vandewoude & Buyssens, 1992a; Hill & Olson, 2008; Brinks et al. 2009; Tian et al. 2010; Baskin & Taegtmeyer, 2011). По време на гладуването е отбелязано намаляване на съотношението на обема на митохондриите към миофибрилите, както и разширяване на кардиомиоцитната Т-система (Vandewoude & Buyssens, 1992a). Биохимичният анализ на сърца от зайци, гладували за 0, 3 или 7 дни, разкрива, че намаленият синтез на нови протеини, особено тези на миофибрилите, и намаленият полуживот на протеини значително допринасят за сърдечната атрофия (Samarel et al. 1987). Интересното е, че в механично натоварените сърца сърдечната атрофия включва пътища както на синтез на протеини, така и на разграждане, което показва активен процес на атрофично ремоделиране (Razeghi et al. 2003). В скорошно проучване за ефектите на раковата кахексия при мишката, ние съобщихме, че обемът на миофибриларите намалява, въпреки че общата маса на лявата камера и общия обем на кардиомиоцитите остават същите. Освен това съобщихме, че раковата кахексия е свързана с намаляване на инервацията на миокарда до приблизително 50% от контролните стойности (Mühlfeld et al. 2011). Дали този ефект е свързан със загубата на телесно тегло или други патогенни фактори като повишени нива на цитокини не е ясно.

Повечето от проучванията за кардиоремоделиране, предизвикано от калорични ограничения или глад, са фокусирани върху атрофичния отговор на кардиомиоцитите, докато ремоделирането на микросредата на кардиомиоцитите, а именно капилярите и инервацията, не е изследвано. Всъщност само едно проучване се занимава с промените в миокардните капиляри при недохранване. Повечето от параметрите са относителни стойности като обем или повърхностна плътност и поради това е трудно да се свържат с промените в кардиомиоцитния отдел (Vandewoude & Buyssens, 1992b). По-специално, връзката и ходът на промените, причинени от калорични ограничения в различните отдели на миокарда, в момента не са известни. Непропорционалното преустройство между отделенията може да бъде от клинично значение, особено при пациенти, които страдат от сърдечни заболявания и започват да отслабват доброволно или неволно.

В светлината на тези съображения и предишната ни работа върху раковата кахексия, ние предположихме, че ремоделирането на лявата камера, предизвикано от ограничаване на калориите, е пропорционален атрофичен процес, включващ капиляри, нервни влакна и кардиомиоцити едновременно и в подобна степен. За да тестваме тази хипотеза, подложихме мишките на калорични ограничения с 50% за 0, 3 и 7 дни и изследвахме лявата камера, използвайки стереологични методи, основани на дизайна. По-конкретно се изчислява общият обем на кардиомиоцитите и техните органели, както и общата дължина на капилярите и аксоните. За разлика от нашата хипотеза, ремоделирането на лявата камера, предизвикано от ограничаване на калориите, включва само кардиомиоцитното и капилярното отделение, а не инервацията, и ние предлагаме, че промените във взаимодействието на различните миокардни компоненти трябва да бъдат разгледани в бъдещи проучвания за атрофично ремоделиране.

Материали и методи

Животни

Общо 15 възрастни мъжки 8-седмични мишки на възраст C57BL/6J са закупени от Charles River Laboratories (Франция) и са разпределени на случаен принцип в контролна, 3-дневна калорична рестрикция и 7-дневна калорична рестрикционна група (n = 5 всяка). Мишките бяха държани в специално изработени метаболитни клетки (по една мишка на клетка) в продължение на 4 дни, за да свикнат с новата среда с достъп до храна и вода ad libitum, контролирана температура и осветление (12 часа цикъл светлина-тъмнина). През тези 4 дни беше изчислен средният прием на храна на мишка и след това мишките от 3- и 7-дневните групи бяха подложени на калорични ограничения с 50% от спонтанния прием. Всички експерименти бяха проведени в съответствие с институционалните насоки, които съответстват на националните и международни разпоредби и бяха одобрени от местните власти.

Животните бяха убити чрез вдишване на изофлуран и последващо обезкървяване чрез прерязване на коремната кавална вена. След това гръдният кош се отваря, сърцето бързо се изрязва и се потапя в 4 ° C студен фиксатор, съдържащ 4% параформалдехид във фосфатно буфериран физиологичен разтвор. Сърцето се задържа във фиксатора поне 24 часа при 4 ° С. Сърцето беше претеглено, а предсърдията и дясната камера бяха отстранени от лявата камера. Последният беше претеглен, разрязан надлъжно и три пъти напречно. Получените осем парчета бяха систематично, еднакво, произволно взети проби, за да се получат четири парчета тъкан за вграждане на парафин. От останалите четири парчета едната беше избрана на случаен принцип, претеглена внимателно и отделно вградена в парафин, докато останалите три екземпляра бяха вградени в епоксидна смола. Вграждането на парафин се извършва съгласно стандартни протоколи. За вграждане на епоксидна смола, пробите се фиксират в 1% осмиев тетроксид в аква бидест, оцветяват се в полу-наситен воден уранил ацетат, дехидратират се във възходящ етанол и накрая се влагат в Epon.

Стереология

Използваните в това проучване стереологични методи са добре установени и са обект на скорошен преглед (Mühlfeld et al. 2010a). За светлинна микроскопична стереология е използван микроскоп Olympus BX51 (Olympus, Хамбург, Германия), оборудван с цифров фотоапарат (Olympus DP72) и новия стереологичен софтуер CAST (Visiopharm, Horsholm, Дания). Трансмисионната електронна микроскопия се извършва с помощта на електронен микроскоп LEO 902 (Zeiss, Oberkochen, Германия). Всички зрителни полета (FOV) за стереологичен анализ са получени чрез систематично еднакво произволно вземане на проби (Gundersen & Jensen, 1987).

За стереологичния анализ на кардиомиоцитите, полуразделените и ултратънките срезове бяха изрязани от вградените в Epon тъканни блокове и оцветени съответно с толуидиново синьо и оловен цитрат/уранилацетат. Решетки с точки за изпитване бяха проектирани върху FOV и броят на точките, удрящи структури от интерес. На нивото на светлинното микроскопично (увеличение на обективната леща: 40 ×) броят точки, удрящи кардиомиоцитите и интерстициума, се отчита и използва за изчисляване на обемната част на тези отделения съгласно уравнението VV (str/ref) = P (str)/P (ref), където VV (str/ref) е обемната част на структура от интерес по отношение на референтен обем, P (str) е броят точки, удрящи структурата на интерес, а P (ref) е общият брой точки, удрящи референтния обем. На електронно микроскопско ниво (първично увеличение: 7000 ×) броят на точките, удрящи миофибрили, митохондрии, свободна саркоплазма и ядрото, беше преброен, за да се изчисли обемната част на тези отделения, свързани с кардиомиоцита, като референтен обем, както е описано по-горе. Обемните плътности се умножават по съответния референтен обем, за да се получи общият обем на отделенията.

Общата дължина на аксоните, размножаващи се между кардиомиоцитите, е оценена по наскоро установен метод (Mühlfeld et al. 2010b). Профилите на нервните влакна се визуализират чрез имунохистохимия за протеинов генен продукт 9.5 (PGP9.5; Gulbenkian et al. 1987). При увеличение на обективната леща от 40 ×, броят на PGP9.5-положителните профили на нервните влакна се отчита, ако те лежат в зоната на непредубедена рамка за броене, проектирана върху произволно взети проби FOV. Използвайки същото уравнение като за плътността на дължината на капилярите, се изчислява плътността на дължината на нервните влакна. На електронно микроскопско ниво (първично увеличение: 20 000 ×) се използва систематично еднакво произволно вземане на проби за получаване на FOV, съдържащи нервни влакна. От тези снимки се изчислява и умножава средният брой аксонови профили на профил на нервните влакна и се умножава с общата дължина на нервните влакна, за да се получи общата дължина на аксоните във вентрикула. Освен това средният диаметър на аксоните беше измерен като най-големия диаметър, ортогонален на диаметъра на най-дългия профил на аксон.

По време на вграждането на парафин се получава висока и непредсказуема степен на свиване на тъканите и води до фалшиви оценки, ако плътностите, получени от секциите, просто се умножат по референтния обем преди вграждането (Dorph-Petersen et al. 2001). Следователно от всяко животно единият тъканен блок, който е бил вграден отделно в парафин, е изцяло нарязан на секции с дебелина 7 μm. Използвайки принципа на Кавалиери (Howard & Reed, 2005), беше изчислена площта на тези секции, умножена по дебелината на сечението и общия брой секции. Този микроскопски определен обем след вграждането и обемът, измерен преди вграждането, бяха използвани за изчисляване на свиването на тъканите поради вграждане. Включен е фактор, коригиращ свиването на тъканите, за да се коригира плътността на дължината на нервните влакна. Не е направена такава корекция за проби, вградени в Epon, тъй като предишни проучвания показват, че свиването на тъканите в епоксидна смола е незначително (Dorph-Petersen et al. 2001; Eisele et al. 2008).