Концептуализация на роли, куриране на данни, официален анализ, придобиване на финансиране, разследване, валидиране, писане - оригинален проект, писане - преглед и редактиране

система

Отделение по физиология и регенеративна медицина, Университет Киндай, Медицински факултет, Осакасаяма, Япония

Роли Куриране на данни

Отделение по физиология и регенеративна медицина, Университет Киндай, Медицински факултет, Осакасаяма, Япония

Роли Куриране на данни

Отделение по физиология и регенеративна медицина, Университет Киндай, Медицински факултет, Осакасаяма, Япония

Роли Куриране на данни

Институт за научни изследвания в областта на науката за живота, Университет Киндай, Осакасаяма, Япония

Роли Куриране на данни

Филиологичен отдел по физиология, Медицински факултет на университета Гифу, Гифу, Япония

Роли Куриране на данни

Отделение по биология на генома, Медицински факултет, Университет на Цукуба, Цукуба, Япония

Роли Концептуализация, формален анализ, придобиване на финансиране, надзор, писане - преглед и редактиране

Отделение по физиология и регенеративна медицина, Университет Киндай, Медицински факултет, Осакасаяма, Япония

  • Наоуки Кавао,
  • Йошимаса Такафуджи,
  • Масайоши Ишида,
  • Кацуми Окумото,
  • Хиронобу Морита,
  • Масафуми Муратани,
  • Хироши Каджи

Фигури

Резюме

Вестибуларната система контролира баланса, стойката, кръвното налягане и погледа. Ролите на вестибуларната система в метаболизма на енергия и глюкоза обаче остават неизвестни. Тук изследвахме ролята на вестибуларната система при затлъстяване и нарушен метаболизъм на глюкозата, използвайки мишки с вестибуларни лезии (VL), хранени с диета с високо съдържание на захароза/високо съдържание на мазнини (HSHFD). VL се предизвиква чрез операция или арсен. VL значително потиска телесните мазнини, подобрени от HSHFD при мишки. Непоносимостта към глюкоза се подобрява от VL при мишки, хранени с HSHFD. VL притъпи нивата на адипогенни фактори и провъзпалителни адипокини, повишени от HSHFD в епидидималната бяла мастна тъкан на мишки. Β-блокер антагонизира непоносимостта към телесни мазнини и глюкоза, засилен от HSHFD при мишки. Резултатите от анализ на секвениране на РНК показват, че HSHFD индуцира промени в гени, като инсулиноподобен растежен фактор-2 и глиален фибриларен киселинен протеин, във вестибуларните ядра на мишките през вестибуларната система. В заключение, ние тук демонстрирахме, че нарушеното регулиране на вестибуларната система влияе върху състоянието на затлъстяване и нарушен метаболизъм на глюкозата, индуциран от HSHFD при мишки. Вестибуларната система може да допринесе за регулирането на зададените точки при излишни енергийни условия.

Цитат: Kawao N, Takafuji Y, Ishida M, Okumoto K, Morita H, Muratani M, et al. (2020) Роли на вестибуларната система при затлъстяване и нарушен метаболизъм на глюкозата при мишки, хранени с високо съдържание на мазнини. PLoS ONE 15 (2): e0228685. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0228685

Редактор: Барбара Фам, Университет в Мелбърн, АВСТРАЛИЯ

Получено: 2 ноември 2019 г .; Прието: 20 януари 2020 г .; Публикувано: 3 февруари 2020 г.

Наличност на данни: Всички релевантни данни се намират в хартията и нейните поддържащи информационни файлове.

Финансиране: Това проучване беше частично подкрепено с безвъзмездна финансова помощ от Takeda Science Foundation за NK, безвъзмездна помощ от Kindai Research Enhancement Grant (21st Century Joint Enhancement Grant) за HK, безвъзмездна помощ за научни изследвания (C: 16K08534, 19K07310 ) за NK и безвъзмездна помощ за научни изследвания в иновативни области (номер на субсидия 15H05935, „Живот в космоса“) на HK от Министерството на образованието, културата, спорта, науката и технологиите на Япония. Финансистите не са играли роля в дизайна на проучването, събирането и анализа на данни, решението за публикуване или подготовката на ръкописа.

Конкуриращи се интереси: Авторите са декларирали, че не съществуват конкуриращи се интереси.

Въведение

Линейното и ъгловото ускорение на главата се усеща от вестибуларните епителни клетки и след това се предава на вестибуларни ядра чрез вестибуларни неврони. Невроните на вестибуларните ядра са контролен център за възприемане на баланса, а вестибуларната система е свързана с други невронални тракти, като вестибуло-окуломоторния и вестибуло-гръбначния тракт, които регулират погледа на очите чрез вестибуло-очни рефлекси и позата, съответно [ 1,2]. Освен това невроните на вестибуларното ядро ​​се свързват с автономната нервна система и регулират сърдечно-съдовата система като вестибуло-автономни рефлекси [2,3].

По отношение на връзките между вестибуларната система и скелетните органи, предишни проучвания разкриват, че вестибуларните лезии (VL) намаляват костната минерална плътност (КМП) чрез симпатиковата нервна система при гризачи [4,5]. Luxa и сътр. съобщава, че лабиринтектомията увеличава ремоделирането на миофибрите в мускула на подметката на мишки [6]. Наскоро разкрихме, че гравитационните промени засягат мускулите и костите чрез вестибуларната система при мишки [7,8]. Колективно тези открития предполагат, че вестибуларната система регулира мускулно-скелетната система отчасти чрез симпатиковата нервна система. Дисфункциите във вестибуларната система клинично причиняват световъртеж, световъртеж и нестабилност [9]. Дългосрочният космически полет уврежда вестибуларната система при астронавтите, които изпитват ортостатична непоносимост и нестабилност [3]. Ролите на вестибуларната система в метаболитната хомеостаза обаче все още не са изяснени в детайли.

Излишната енергия се съхранява в бяла мастна тъкан (WAT) като липиди и причинява затлъстяване, рисков фактор за диабет [10]. Адипоцитите се диференцират от мезенхимните стволови клетки и активирането на адипогенната диференциация е последвано от повишени нива на активиран от пероксизома пролифератор рецептор γ (PPARγ), aP2, дълговерижна ацил-КоА синтетаза (ACSL) 1 и липопротеин липаза (LPL). При затлъстяване WAT освобождава провъзпалителни адипокини, като фактор на туморна некроза (TNF) -α, инхибитор на плазминогенен активатор (PAI) -1 и моноцитен хемоаттрактант протеин (MCP) -1, които нарушават метаболизма на глюкозата поради индуцирането на ниски нива -гресивно системно възпаление [10]. Адипонектинът и лептинът, освободени от мастната тъкан, оказват плейотропни ефекти в метаболизма на глюкозата [10]. Циркулиращият адипонектин и лептин, произведени от WAT, са отрицателно и положително свързани съответно с мастната маса [11,12]. Предишни открития показват, че активираната хипоталамусна система лептин/меланокортин, намалени нива на адипонектин и хиперинсулинемия усилват симпатиковата нервна активност при затлъстяване [13–15].

В настоящото проучване изследвахме влиянието и механизма на действие на VL върху затлъстяването и нарушения метаболизъм на глюкозата, като използвахме диети с високо съдържание на захароза/високо съдържание на мазнини (HSHFD) с VL, индуцирани от операция и токсични химикали, за да изясним ролята на вестибуларната система при диета, индуцирано затлъстяване и нарушен метаболизъм на глюкозата.

Материали и методи

Декларация за етика

Всички експерименти с животни са извършени в съответствие с насоките на Националния здравен институт и институционалните правила за използване и грижи за лабораторни животни в университета Киндай. Всички процедури бяха одобрени от Експерименталния комитет за хуманно отношение към животните към Университета Киндай (Номер на разрешителното: KAME-27-029). Всички усилия бяха положени да сведат до минимум страданието. Мишките бяха евтаназирани с излишен изофлуран.

Експерименти с животни

Мъжки мишки C57BL/6J са закупени от CLEA Japan (Токио, Япония). Мишките се хранят ad libitum с HSHFD (28% от калориите от въглехидрати и 55% от мазнините, ориенталски дрожди, Токио, Япония) или нормална диета (ND) и вода от 9-седмична възраст в продължение на 4 или 8 седмици. След 6 часа на гладно, мишките бяха евтаназирани с излишен изофлуран и бяха събрани тъканни проби.

Хирургични вестибуларни лезии (sVL)

Мъжки мишки C57BL/6J (на 7 седмици) бяха разделени на случаен принцип в 4 групи: ND/Sham (n = 8), ND/sVL (n = 8), HSHFD/Sham (n = 8) и HSHFD/sVL (n = 8). VL хирургия е била извършена двустранно в съответствие с метода, описан по-рано при мишки с 2% изофлуранова анестезия [7]. Накратко, ушните костилки бяха отстранени през външния слухов проход. Преддверието е било увредено чрез вкарване на зъбен разширител през овалния прозорец във вътрешното ухо, последвано от аблация с помощта на апарат за изгаряне. Ефектите от VL хирургия върху вестибуларната система се оценяват чрез тест за плуване, както е описано по-горе [23], при който мишки с вестибуларна дисфункция не могат да плуват и продължават да се въртят под топлата вода (35 ° C). При фалшиви мишки тимпаничната мембрана беше премахната, но останаха ушни костилки и преддверие. След двуседмичен период на възстановяване, мишките са хранени с ND или HSHFD в продължение на 8 седмици.

Индуцирани от арсен вестибуларни лезии (aVL)

Мъжки мишки C57BL/6J (на възраст 9 седмици) бяха разделени на случаен принцип в 4 групи: ND/Control (n = 8), ND/aVL (n = 8), HSHFD/Control (n = 8) и HSHFD/aVL (n = 8). VL с използване на натриев арсанилат е двустранно индуциран в съответствие с описания по-рано метод [24]. Под 2% анестезия на изофлуран, 10 μl натриев арсанилат (Tokyo Chemical Industry, Tokyo, Japan), разтворен във физиологичен разтвор, се инжектира в кухината на средното ухо (1,5 mg/ухо). При контролни мишки се инжектира двустранно същия обем физиологичен разтвор. Мишките бяха хранени с ND или HSHFD в продължение на 4 седмици от 1 ден след процедурата за aVL.

Лечение с пропранолол

Мъжките мишки C57BL/6J бяха разделени на 4 групи: ND/Control (n = 8), ND/пропранолол (n = 8), HSHFD/Control (n = 8) и HSHFD/пропранолол (n = 8). Пропранолол (Sigma, Сейнт Луис, Мисури, САЩ) се прилага на 9-седмични мишки чрез питейна вода при 0,5 g/l в продължение на 8 седмици, както е описано по-рано [8].

Тестове за глюкоза и инсулинов толеранс

Глюкоза (Wako, Осака, Япония) при 1,5 g/kg и инсулин (Eli Lilly Japan, Kobe, Япония) при 0,5 U/kg се прилагат интраперитонеално на мишки, съответно за тестове за толерантност към глюкоза и инсулин. Нивата на кръвната захар бяха измервани преди и 30, 60, 90 и 120 минути след инжектирането.

Измерване на силата на сцепление

Силата на сцепление на мишките беше измерена пет пъти с помощта на измервател на силата на сцепление (1027SM, Columbus Instruments, Columbus, OH, USA) и получените резултати бяха изразени като средно, както е описано по-горе [25].

Количествена компютърна томография (QCT)

След като мишките бяха упоени с 2% изофлуран, беше проведено QCT сканиране с помощта на рентгенова CT система (Latheta LCT-200; Hitachi Aloka Medical, Токио, Япония) със следните параметри: 500-μA тръбен ток, 50-kVp напрежение на тръбата и 48-мм аксиално зрително поле, както е описано по-горе [7]. При анализи на общата мастна и мускулна маса, както и общото съдържание на минерали в костите (BMC), бяха получени CT изображения (размер на воксела 96 × 192 × 1008 μm) и районът на интерес беше определен като цялото тяло. При анализи на трабекуларна и кортикална КМП на тибията са получени CT изображения с 24-μm изотропен размер на воксела и областите от интерес са определени като 1680-μm сегменти от 96 μm дистално до края на проксималната растежна плоча към диафизата и 2160 -μm сегменти от средата на диафизата, съответно. CT изображенията бяха анализирани с помощта на софтуера LaTheta (версия 3.41).

Хистологичен анализ

Epididymal WAT беше фиксиран в 4% параформалдехид за 24 часа, вграден в парафин и нарязан на участъци с дебелина 4 μm. Секциите се оцветяват с хематоксилин и еозин и се снимат с помощта на микроскоп (E800; Canon, Токио, Япония) с CCD камера. Площите на напречното сечение на най-малко 350 адипоцити бяха количествено определени чрез планимиметрия, използвайки ImageJ по заслепен начин.

PCR анализ в реално време

Общата РНК беше извлечена с помощта на RNeasy Mini kit (Qiagen, Hilden, Германия) в съответствие с инструкциите на производителя. cDNA се синтезира, използвайки cDNA комплект за обратна транскрипция с голям капацитет (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Извършен е PCR анализ в реално време, използвайки ABI PRISM 7900HT (Thermo Fisher Scientific) и Fast SYBR Green Master Mix (Thermo Fisher Scientific), както е описано по-горе [25]. Праймерите, използвани за PCR в реално време, са показани в таблица S1. Относителните нива на иРНК на целевите гени бяха анализирани по метода ΔΔCt и нормализирани с нива на 18S рРНК.

Химия на кръвта

Нивата на серумен инсулин, лептин и адипонектин се оценяват, като се използва набор за анализ на имуносорбентен инсулинов мишки за мишки (кат. № AKRIN-011T, FUJIFILM Wako Shibayagi, Gunma, Япония), мишка/плъх лептин Quantikine ELISA комплект (кат. No. MOB00, R&D системи, Минеаполис, MN, САЩ) и набор за анализ на имуносорбентен ензимен мишки/плъх адипонектин (кат. № AKMAN011, FUJIFILM Wako Shibayagi), съответно.

РНК секвениране

Коронарните филийки с дебелина един милиметър са получени от мозъка на мишката, използвайки матрична мозъчна матрица (Muromachi Kikai, Токио, Япония). Вестибуларните ядра са събрани с помощта на удар според мозъчния атлас на Алън Мишка [26]. Общата РНК беше извлечена от биопсични проби, използвайки реагент TRIzol (Thermo Fisher Scientific) и оценена с помощта на Agilent Bioanalyzer с RNA 6000 Pico Kit (Agilent, Санта Клара, Калифорния, САЩ). Изчерпването на рРНК и синтезът на библиотеки бяха извършени, използвайки NEBNext rRNA Depletion Kit (E6310, New England Biolabs, Ipswich, MA, USA) и NEBNext Ultra Directional RNA Library Prep Kit (E7420, New England Biolabs) от 500 ng от общата РНК. Качеството на библиотеката беше проверено с помощта на биоанализатора Agilent с ДНК комплект за висока чувствителност (Кат. № 5067–4626, Agilent). Всяка библиотека беше секвенирана с помощта на Illumina (2 × 36-bp сдвоени четения) с NextSeq500 High Output Kit v2 (Illumina, Сан Диего, Калифорния, САЩ). Файловете FASTQ бяха импортирани в CLC Genomics Workbench (ver.10.1.1, Qiagen, Germantown, MD, USA). Показанията са картографирани в референтния геном на мишка mm10 и са количествено определени за 49 585 анотирани гени. Четенията на килобаза на стенограмите на милион отчетени стойности (RPKM) бяха нормализирани по квантилен метод.

Статистически анализ

Данните са изразени като средни стойности ± стандартни грешки на средната стойност. Значителните разлики бяха анализирани с помощта на двупосочен дисперсионен анализ, последван от теста на Tukey-Kramer. Стойностите на Р по-малко от 0,05 се считат за значими. Статистическите анализи бяха извършени с помощта на GraphPad PRISM 7.00 (GraphPad Software, Сан Диего, Калифорния, САЩ).

Резултати

Ефекти на sVL върху индуцираното от HSHFD затлъстяване

Телесното тегло, общата мастна маса и размерът на адипоцитите в WID на епидидима са значително по-високи при мишки, хранени с HSHFD, отколкото при мишки, хранени с ND (Фигура 1А и 1В). sVL значително намали телесното тегло, общата мастна маса и размера на адипоцитите, подобрени от HSHFD, но не повлиява приема на калории със или без HSHFD (Фигура 1А и 1В). sVL потиска нивата на mRNA на ACSL1, повишени от HSHFD в епидидималната WAT на мишки (Фигура 1C), докато HSHFD не влияе на нивата на mRNA на PPARy, aP2 или LPL в епидидималната WAT на мишки (Фигура 1C). Общата мускулна маса е значително по-ниска при мишки, хранени с HSHFD, и sVL значително намалява общата мускулна маса със или без HSHFD (Фигура 1D). Въпреки че храненето с HSHFD не повлиява теглото на тъканите на мускулите на солеуса и гастрокнемиума или силата на сцепление при мишки, sVL значително намалява теглото на тъканта на мускулите на гастрокнемия при мишки, хранени с ND или HSHFD (Фигура 1D) Що се отнася до костите, храненето с HSHFD в продължение на 8 седмици не повлиява общата BMC или трабекуларната и кортикалната BMD на тибията при мишки (Фигура 1Е). sVL значително намалява общата BMC и трабекуларната BMD на тибията при мишки, хранени с ND и HSHFD (Фигура 1Е).

(А) Нивата на кръвната глюкоза на гладно и серумния инсулин са измерени 8 седмици след започване на храненето с ND или HSHFD. (B, C) Отговори на кръвната глюкоза на еднократно интраперитонеално инжектиране на глюкоза (B) и инсулин (C) при фалшива хирургия и sVL мишки 8 седмици след започване на хранене с ND или HSHFD. Изчислява се площта под кривата (AUC) за 120 минути. (D) Обща РНК беше извлечена от чернодробни тъкани при фалшива хирургия и sVL мишки 8 седмици след започване на хранене с ND или HSHFD. След това беше извършен PCR анализ в реално време. Данните са изразени по отношение на нивата на 18S рРНК. * P Фиг. 3. Ефекти на aVL върху мастната маса и метаболизма на глюкозата при мишки, хранени с HSHFD в продължение на 4 седмици.

(A) Данни за телесното тегло и приема на калории от контролни (Cont) и aVL мишки, хранени с ND или HSHFD. Телесното тегло е измерено 4 седмици след ND или HSHFD хранене. Приемът на храна се събира в продължение на 3 дни на дни от 26 до 28 след започване на храненето с ND или HSHFD и се показва като представител на средния дневен прием на калории. (B) Мастната маса в цялото тяло на контрола и aVL мишки се оценява чрез QCT 4 седмици след започване на храненето с ND или HSHFD. Теглото на тъканите на епидидимална бяла мастна тъкан (WAT) е измерено 4 седмици след хранене с ND или HSHFD. (C) Обща РНК се извлича от епидидималната WAT на контрола и aVL мишки 4 седмици след започване на хранене с ND или HSHFD. След това беше извършен PCR анализ в реално време. Данните са изразени по отношение на нивата на 18S рРНК. (D) Нивата на кръвната захар и инсулин на гладно са измервани 4 седмици след започване на храненето с ND или HSHFD. (E, F) Отговори на кръвната глюкоза на еднократна интраперитонеална инжекция на глюкоза (E) и инсулин (F) в контрола и aVL мишки 4 седмици след започване на хранене с ND или HSHFD. Изчислява се площта под кривата (AUC) за 120 минути. * P Фиг. 4. Ефекти на sVL и aVL върху нивата на адипокин при мишки, хранени с HSHFD.

(А) Обща РНК беше извлечена от епидидималната WAT на фалшива хирургия и sVL мишки 8 седмици след започване на храненето с ND или HSHFD. След това беше извършен PCR анализ в реално време. Данните са изразени по отношение на нивата на 18S рРНК. Серумни проби бяха събрани от фалшива хирургия и sVL мишки 8 седмици след започване на храненето с ND и HSHFD. Проведено е количествено определяне на нивата на серумния лептин и адипонектин. (B) Обща РНК се извлича от епидидималната WAT на контрола (Cont) и aVL мишки 4 седмици след започване на хранене с ND или HSHFD. След това беше извършен PCR анализ в реално време. Данните са изразени по отношение на нивата на 18S рРНК. Серумни проби бяха събрани от контролни и aVL мишки 8 седмици след започване на храненето с ND и HSHFD. Проведено е количествено определяне на серумните нива на лептин. * P Фигура 5. Ефекти от лечението с пропранолол върху мастната маса и метаболизма на глюкозата при мишки, хранени с HSHFD в продължение на 8 седмици.