Биология на клетъчния стрес, Институт за рак на Розуел Парк, Бъфало, Ню Йорк, 14263 САЩ

Биология на клетъчния стрес, Институт за рак на Розуел Парк, Бъфало, Ню Йорк, 14263 САЩ

Биология на клетъчния стрес, Институт за рак на Розуел Парк, Бъфало, Ню Йорк, 14263 САЩ

Михаил В. Благошклони, Институт за рак на Розуел Парк, Elm and Carlton sts, Бъфало, Ню Йорк 14263, САЩ. Тел .: 716 845 3326; факс: 716 845 3944;

Биология на клетъчния стрес, Институт за рак на Розуел Парк, Бъфало, Ню Йорк, 14263 САЩ

Биология на клетъчния стрес, Институт за рак на Розуел Парк, Бъфало, Ню Йорк, 14263 САЩ

Биология на клетъчния стрес, Институт за рак на Розуел Парк, Бъфало, Ню Йорк, 14263 САЩ

Михаил В. Благошклони, Институт за рак на Розуел Парк, Elm and Carlton sts, Бъфало, Ню Йорк 14263, САЩ. Тел .: 716 845 3326; факс: 716 845 3944;

Обобщение

Въведение

Резултати

Рапамицин има тенденция да намалява телесното тегло при високочестотна диета

Три групи мъжки мишки на диета с високо съдържание на мазнини бяха лекувани от i.p. инжекции със следните периодични схеми: R1 - 1,5 mg kg -1 три пъти седмично през седмица; R2 (седмична схема) - 1,5 mg kg -1 седмица -1; и R3 - 0,5 mg kg -1 три пъти седмично през седмица (фиг. 1). Тези групи мишки са били хранени с високочестотна храна в продължение на 3 месеца преди началото на настоящото проучване (експериментални процедури, предистория). Така че в началото на лечението и трите лечебни групи са били със затлъстяване (фиг. 1) и са подобни на контролната група с високочестотна диета (сравнете теглата на седмица 0 на фиг. 1). Когато това лечение започна (фиг. 1), имаше преходно намаляване на абсолютното телесно тегло в три групи, лекувани с рапамицин (фиг. 1). За разлика от това контролните мишки на диета с високо съдържание на мазнини продължават да напълняват, докато достигнат плато след 8 месеца (фиг. 1 и фиг. S1, подкрепяща информация). До края на експеримента мишки от група R2 показаха тенденция да тежат по-малко от контролните HF мишки (фиг. 1). Налице е статистически значимо, макар и преходно намаляване на наддаването на тегло в R2 група в сравнение с HF контролната група (фиг. S1, подкрепяща информация, обозначена със звездички).

седмичното

Рапамицин удължава продължителността на живота при затлъстели мъжки мишки

Анализът на общата преживяемост на отделни групи, лекувани с рапамицин, спрямо контролни мишки с HF разкрива, че седмичното лечение с рапамицин (график R2) значително предотвратява заболеваемостта и смъртта при затлъстели мъжки мишки на HF диета (фиг. 2А). Докато 60% от контролните мишки на диета с високо съдържание на мазнини са умрели или са били жертвани поради заболеваемост, всички мишки от групата R2 са оцелели. (Причината за смъртта не винаги е била определяна, така че ние не предоставяме тези данни). Имаше голяма статистически значима разлика (P = 0,0063) в общата преживяемост на мишки в група R2 в сравнение с контролната HF група (Фиг. 2А). Степента на преживяемост и на трите групи, лекувани с рапамицин, взети заедно за анализ, също е значително по-висока в сравнение с контролната HF група (P = 0,028, фиг. 2В). По този начин е постигнато значение за група R2 и за трите получени рапамицин групи, взети заедно, спрямо групата с HF. Редуващи се двуседмични лечения (групи R1 и R3) показват тенденция към увеличаване на преживяемостта, но това не е статистически значимо (фиг. S2, подкрепяща информация).

Нива на p ‐ S6 при оцелели мишки

След единадесет месеца лечение, когато 60% от мишките от HF контролната група умряха, експериментът беше спрян, за да се изследват оцелелите мишки. И в трите групи, лекувани с рапамицин, мишките бяха умъртвени 8 дни след последното лечение, за да се елиминират преките ефекти на рапамицин върху изследваните параметри. Ние фокусирахме изследването върху сърцето и черния дроб. Предишни доклади сочат към сърцето (сърдечния мускул), че също е много важна тъкан за измерване на фосфо-S6 (Hua и др., 2011; Леонтиева и др., 2012a, 2013b; Рамос и др., 2012; Флин и др., 2013; Ву и др., 2013; Джоу и др., 2013 ). Сърцето е един от най-често изследваните органи при стареене, а лечението с рапамицин подобрява състоянието на сърцето. Освен това сърдечно-съдовите заболявания са най-честата причина за смърт при хората. Важното е, че предишните ни изследвания включват сърдечния фосфо-S6 като потенциален маркер за дълголетие и хипертрофия на животните (Леонтиева и др., 2013б) (Леонтиева и др., 2012a; Флин и др., 2013 ).

В групата R2 нивата на сърдечния p-S6 са статистически по-ниски, отколкото в контролната група HF (Фиг. 3). P-S6 отразява активността на mTORC1, за която е известно, че участва в стареенето. Също така измерихме фосфорилирането на AKT при S473, което отчасти е маркер на активността на mTORC2. За разлика от p-S6, p-AKT (S473) не е намален в R2 група (фиг. 3).

Ние също оценихме тези параметри в черния дроб. В съгласие нивата на p-S6 в черния дроб са значително по-ниски в групата R2 в сравнение с HF контрола. Подобно на сърцата, чернодробните нива на p-AKT (S473) имат тенденция да бъдат по-високи в групата R2, въпреки че не достигат статистическа разлика в този конкретен тест (фиг. 4). Забележително е, че нивата на p-S6 и p-Akt в бъбреците не се различават в контролните и лекуваните с рапамицин групи и p-S6 и p-Akt силно корелират (фиг. S4, подкрепяща информация).

2-годишни мъжки мишки на диета с високо съдържание на мазнини (HF): контрол (HF - нелекуван) или лекуван с рапамицин (представени групи R2 и R3 - HF/R2, HF/R3). Цифрите показват отделни мишки. Равното натоварване беше потвърдено и чрез оцветяване на мембраната с Commassie Blue (Фиг. S3, Допълнителна информация). (Б). Количествен анализ на данните, показани на фиг. 4А. Количествените интензитети на сигнала p-S6 и сигнала на p-AKT (Ser473), представени като средна стойност ± SE.

Третираните седмично мишки не са имали метаболитни отклонения

Дискусия

mTOR се активира от инсулин, IGF-1 и възпалителни цитокини (Zoncu и др., 2011; Cornu и др., 2012), всички от които са маркери за бързо стареене и лошо здраве. Освен това, активираният mTOR/S6K път може да причини инсулинова резистентност (Khamzina и др., 2005; Кребс и др., 2007). Следователно, по-ниските нива на гладно p-S6 могат да бъдат маркер за по-бавно стареене и метаболитно здраве. Нашето проучване вероятно подценява положителните ефекти на рапамицин, тъй като метаболитните параметри се оценяват само при мишки, оцелели до 2-годишна възраст. Докато всички мишки от група R2 оцеляват до края на експеримента, само 40% мишки оцеляват в контролната група. В контролната HF група мишки с по-кратък живот (по-малко здрави и по-бързо стареене по дефиниция) не оцеляват и по този начин не са включени в изследването на p-S6 и метаболитните параметри.

Това проучване е отправна точка за допълнителна оценка на периодичните графици на рапамицин и за увеличаване на техния потенциал за удължаване на живота чрез модулиране на дозите и честотата. Удължаването на живота чрез интермитентно лечение с рапамицин може допълнително да се усили с диета, антидиабетното лекарство метформин (Анисимов и др., 2011a; Мартин ‐ Монталво и др., 2013) и по възможност физически упражнения. Взети заедно, тези условия могат да подобрят здравето и да увеличат продължителността на живота на застаряващите хора.

Експериментални процедури

Всички проучвания върху животни са проведени в съответствие с разпоредбите на Комитета по грижа и употреба на животните към Института за рак на Розуел Парк.

Праистория [предишно проучване (Леонтиева и др., 2013c)]: 9-месечни мъжки мишки (щам C57BL/6NCr) бяха разделени на 5 групи: едната група получи стандартна лабораторна чау-чау (5% мазнини, нискомаслена) (LF) диета. Четири други групи са получавали 60% диета с високо съдържание на мазнини (Research Diets, Inc, Cat # D12492 Diet Diet 60% kCal% fat; New Brunswick, NJ, USA) (HF) за 3 месеца. Тези четири групи на HF диета бяха, както следва: HF група - контрол (HF), R1 група получи орално ниска доза ресвератрол; R2 група получи орално ниска доза рапамун; и R3 групата получи комбинация от ресвератрол и рапамун, както е описано по-горе (Leontieva и др., 2013в).

Текущо проучване

Една седмица след приключване на първото проучване, експериментални групи (R1-R3) са лекувани с рапамицин (LC Laboratories) чрез i.p инжекции, съгласно следните графици: R1 група е получавала 1,5 mg kg -1 три пъти седмично/през седмица; R2 групата се инжектира с 1,5 mg kg -1 седмица -1 на седмица; и R3 група се прилага по 0,5 mg kg -1 три пъти седмично/през седмица. Лечението продължава 11 месеца и теглото се измерва всяка седмица. На осмия ден след последното третиране, мишките се гладуват цяла нощ и се жертват. Кръв се събира в края на деня, преди да се отстрани храната за гладно през нощта. На следващата сутрин се събира кръв на гладно и се принасят в жертва мишки. Непостената и гладната плазма бяха подготвени, съответно, за биохимичен анализ.

Рапамицин (LC Laboratories, Woburn, MA, USA) се разтваря в етанол при 15 mg mL -1 (запас) и след това се разрежда до 0,15 mg mL -1 в PBS, съдържащ 5% Tween-80, 5% PEG 400 и 4% етанол.

Имуноблот анализ

Тъканите се хомогенизират и се извършва имуноблотинг, както е описано по-рано (Leontieva и др., 2012а). Заешки антифосфо S6 (Ser 240/244), антифосфо-АКТ (Ser473), общ АКТ и анти-S6 бяха използвани от нас, както беше описано по-рано (Леонтиева и др., 2012в) и закупени от клетъчната сигнална биотехнология (Данвърс, Масачузетс, САЩ); моноклонални анти-β-актин-пероксидаза (AC-15) и миши анти-GAPDH антитела са получени съответно от Sigma-Aldrich (Сейнт Луис, МО, САЩ) и Invitrogen (Grand Island, NY, USA).

Нивата на глюкоза в кръвната плазма са измерени с помощта на ленти Accu-Chek Aviva (McKesson, Atlanta, GA, USA).

Концентрацията на инсулин, IGF1, лептин и триглицериди в кръвната плазма се измерва с помощта на свръхчувствителен ELISA комплект за инсулин (мишка) (ALPCO Diagnostics, Salem, NH, САЩ), комплект ELISA за мишка/плъх (ALPCO), комплект ELISA за мишки Leptin (Crystal Chem Inc, Downers Grove, IL, USA) и Triglyceride Colorimetric Assay Kit (Cayman Chemical Company, Ann Arbor, MI, USA), съответно. Данните бяха анализирани, като се използва диапазон от стандарти и четири параметри логистично приспособяване или линейна регресия.

Статистически анализ

т тестови и корелационни анализи [Pearson r коефициент и P стойност (две опашки)] бяха извършени с помощта на GraphPad Prism версия 5.00 за Windows, GraphPad Software, Сан-Диего, Калифорния, САЩ. www.graphpad.com.

Благодарности

Тази работа беше подкрепена от RPCI. Авторите благодарят на Wei Tan за помощта при статистически анализ на оцеляването на мишките.

Конфликт на интереси

Авторите не декларират конфликт на интереси.

Финансиране

Тази работа е финансирана от института за рак на Розуел Парк (Бъфало, Ню Йорк, САЩ).

Авторски приноси

OVL изпълнява експерименти, анализира данни и пише статията. GMP изпълнява експерименти и анализира данни. MVB е проектирал изследването, анализирал данни и е написал статията.

Описание на името на файла
acel12211-sup-0001-FigS1.jpgimage/jpg, 890,2 KB Фиг. S1 Процент от първоначалното телесно тегло.
acel12211-sup-0002-FigS2.jpgimage/jpg, 850,6 KB Фиг. S2 Криви на оцеляване по Kaplan – Meier за контролни мишки на HF диета (HF, n = 10) и мишки, лекувани по график R1 (n = 10) и R3 (n = 9).
acel12211-sup-0003-FigS3.jpgimage/jpg, 622 KB Фиг. S3 Commassie Оцветена в синьо мембрана от чернодробни петна, показана на фигура 4А, за да потвърди равното натоварване.
acel12211-sup-0004-FigS4.jpgimage/jpg, 984,3 KB Фиг. S4 Нива на p-S6 и p-AKT в бъбреците на оцелели мишки.
acel12211-sup-0005-FigS5.jpg image/jpg, 1 MB Фиг. S5 Нива на гладно и на гладно глюкоза и инсулин в кръвната плазма на мъжки мишки.
acel12211-sup-0006-FigS6.jpgimage/jpg, 802,7 KB Фиг. S6 Корелация между метаболитните параметри в плазмата на гладно.
acel12211-sup-0007-FigS7.jpgimage/jpg, 875 KB Фиг. S7 Криви на оцеляване по Каплан – Майер.
acel12211-sup-0008-TableS1.xlsMS Excel, 14 KB Таблица S1 Крива на оцеляване с високо съдържание на мазнини (HF) и с високо съдържание на мазнини + третирана група 2 с рапамицин (HF + рапамицин (група 2)).
acel12211-sup-0009-TableS2.xlsMS Excel, 15,5 KB Таблица S2 Крива на оцеляване с високо съдържание на мазнини (HF) и групи с високо съдържание на мазнини и рапамицин (HF + рапамицин всички групи).

Моля, обърнете внимание: Издателят не носи отговорност за съдържанието или функционалността на която и да е поддържаща информация, предоставена от авторите. Всички заявки (различни от липсващо съдържание) трябва да бъдат насочени към съответния автор на статията.