Резюме

Заден план

Епигенетиката може да улесни по-доброто разбиране на различията в появата на детско затлъстяване. Докато кръвта е често срещана тъкан, използвана при епигенетични изследвания при хора, слюнката е обещаваща тъкан. Нашите предишни констатации при деца с испанско население в предучилищна възраст, идентифицирани 17 CpG динуклеотиди, за които диференциалното метилиране в слюнката на изходно ниво е свързано със състоянието на майчиното затлъстяване. Настоящото проучване изследва до каква степен изходното метилиране на ДНК в слюнчените проби при тези 3–5-годишни испански деца прогнозира честотата на детското затлъстяване в 3-годишна перспективна кохорта.

Методи

Изследвахме подпроба (н = 92) от участниците в проучването Growing Right Onto Wellness (GROW), които са били произволно избрани на изходно ниво, преди рандомизиране, на базата на фенотип на майката (със затлъстяване или без затлъстяване). Изходни проби от слюнка бяха събрани с помощта на комплект за слюнка Oragene DNA. Обективни данни бяха събрани за височината и теглото на детето на изходно ниво и 36 месеца по-късно. Метилационните масиви бяха обработени по стандартен протокол. Асоциациите между детското затлъстяване на 36 месеца и изходното метилиране на слюнката при предварително идентифицираните 17 CpG динуклеотиди бяха оценени с помощта на многовариативни модели на логистична регресия.

Резултати

Сред н = 75 деца, отговарящи на условията за анализ, изходно метилиране на Cg1307483 (NRF1) е значително свързана с новозарастващо детско затлъстяване при 36-месечно проследяване (ИЛИ = 2,98, стр = 0,04), след коригиране на възрастта на детето, пола, детския изходен BMI-Z и изходния ИТМ за възрастни. Това означава 48% вероятност от детско затлъстяване при 36-месечно проследяване на дете при 75-ия процентил от NRF1 изходно метилиране срещу само 30% шанс за затлъстяване за подобно дете при 25-ия персентил. В съответствие с други проучвания, по-висок изходен BMI-Z на детето през предучилищния период е свързан с появата на затлъстяване 3 години по-късно, но изходното метилиране на NRF1 е свързано с по-късно затлъстяване, дори след коригиране на детския изходен BMI-Z.

Заключения

Слюнката предлага неинвазивни средства за събиране на ДНК и епигенетичен анализ. Нашето доказателство за принципно проучване предоставя солидни емпирични доказателства, подкрепящи метилирането на ДНК в слюнчената тъкан като потенциален предиктор за последващо детско затлъстяване за испаноязычни деца. NFR1 може да бъде цел за по-нататъшно изследване на затлъстяването при тази популация.

Заден план

Разпространението на детското затлъстяване нараства с тревожна скорост през последните четиридесет години [1, 2]. Въпреки че разпространението на детското затлъстяване е глобален проблем, Съединените щати са изправени пред епидемични нива на детско затлъстяване [3, 4]. Центърът за контрол и превенция на заболяванията посочва, че разпространението на затлъстяването сред децата на възраст 2–19 години се е увеличило от 13,9% през 2000 г. на 18,5% през 2016 г. [5]. Някои етнически групи обаче имат дори по-голямо разпространение на затлъстяването [1, 6]. Например, Националното проучване за здравни и хранителни изследвания за периода 2015–2016 г. (NHANES) съобщава, че 25,8% от испаноморските 2–19-годишни са със затлъстяване в сравнение с 14,1% от техните неиспаноядствени бели колеги [7]. Идентифицирането на това, което влияе върху различните популации, е от решаващо значение за успешното намаляване на свързаните със затлъстяването здравни различия.

Епигенетичните модели са тъканно зависими. Докато кръвта е често срещана тъкан, използвана при проучвания на човешки епигенетични промени, слюнката също е обещаваща тъкан. Слюнката може да бъде особено ценна при изследване на педиатрични популации предвид лекотата на достъп до тъкани, икономическата ефективност и възможността да се събира в множество настройки [19, 20]. Абрахам и колеги илюстрираха, че при сравняване на фрагментацията на ДНК, качеството и съгласуваността на генотипа слюнката е сравнима с проби от кръв [21]. Когато се изследват моделите на метилиране, както слюнката, така и кръвта надеждно оценяват епигенетичните модификации [22]. При сравняване на събирането на проби от кръв и слюнка, събирането на слюнка е свързано с по-ниски нива на инфекция, намалени разходи, повишено приемане от пациентите и по-високо съответствие на участниците [23]. Слюнката също има предимството да предлага представа за стомашно-чревния тракт, което би могло да бъде полезно при изследване на затлъстяването. Лекотата на събиране на слюнка, съчетана с вярност на ДНК, може да позволи по-практичен източник на събиране на ДНК за деца. Като се има предвид, че слюнчената тъкан се използва по-рядко за епигенетични изследвания, този подход е нов.

Наскоро Oelsner и сътр. изследва 92 проби от слюнка от 3 до 5-годишни испанци, които са били изложени на риск от затлъстяване, но все още не са затлъстели и анализира 936 гена, свързани преди това със затлъстяването [24]. Проучването в напречно сечение идентифицира 17 CpG динуклеотиди, които демонстрират връзка между изходното диференциално метилиране на детска ДНК и ИТМ на майката (затлъстяване спрямо не-затлъстяване). Докато този анализ беше проведен върху изходни проби от слюнка, тези деца впоследствие участваха в тригодишно надлъжно проучване, при което повече от една трета от децата затлъстяха. Настоящото проучване изследва до каква степен изходните модели на метилиране на ДНК на слюнчената ДНК са свързани с възникващата честота на детско затлъстяване в тази 3-годишна перспективна кохорта от малки испански деца [25].

Методи

Информирано съгласие

Обучен двуезичен изследователски персонал е дал писмено съгласие на родителя или законния настойник на детето, което интересува, на избрания от тях език (английски или испански). Родителят или законният настойник е дал съгласие както за себе си, така и за детето си. Тъй като това беше население с ниска здравна грамотност, процесът на съгласие използваше специфични мерки, за да осигури разбиране на участниците, включително метод за „обратно обучение“ и визуални помощни средства за протокола [26]. Изследването е одобрено от Съвет за преглед на университета Вандербилт (IRB № 120643).

Примерни субекти на изследване на популацията

Изследвахме подпроба (н = 92) от участниците в проучването „Отглеждане точно към уелнес“ (GROW) [24]. Те бяха избрани на случаен принцип на изходно ниво, преди рандомизиране, въз основа на фенотипа на майката. Едната група деца е имала затлъстели майки (BMI ≥30 и обиколка на талията ≥ 100 cm), а другата е имала майки с наднормено тегло (BMI 2) на изходно ниво и 36 месеца. Обученият изследователски персонал събира тегло и ръст на участниците, използвайки стандартни антропометрични процедури, а участниците носят само леки дрехи и без обувки. Височината беше измерена с точност до 0,1 cm с помощта на стадиометър (Perspective Enterprise, Portage, MI), а теглото беше измерено с точност до 0,1 kg с помощта на калибрирана скала. Измерванията на ИТМ бяха събрани с помощта на протокола за изпитване [27]. ИТМ-Z се изчислява въз основа на ИТМ на всяко дете, пол и възраст, а категориите на ИТМ се определят, като се използват указанията на CDC: нормално тегло (

Резултати

От първоначалните 92 участници в извадката на изходното ниво, 75 отговарят на изискванията за контрол на качеството и допустимост и са включени за анализ. Средната възраст е 4,3 години (SD = 0,8), а средният изходен ИТМ е 16,7 (SD = 0,8). В рамките на аналитичната извадка, на изходно ниво, 64,0% (н = 48) са с нормално тегло и 36,0% (н = 27) са с наднормено тегло и 73,3% (н = 55) са били испано-мексикански. Сред родителите 48,0% (н = 36) са били със затлъстяване (стратифицирани по проект за тази подпроба). Вижте Таблица 1 за допълнителни демографски описания на извадката. В заключение на проучването, 37% (н = 28) от децата са били със затлъстяване.

Сравняване на деца, които не са били със затлъстяване на 36 месеца (н = 47) на тези, които са били със затлъстяване на 36 месеца (н = 28), няма статистически значими разлики в изходните детски характеристики, въпреки че описателно свързаните с изходното тегло характеристики изглеждат по-ниски при деца, които не са били със затлъстяване при проследяване. Родителите не са имали съществено различни изходни характеристики между двете групи, въпреки че средната възраст е описателно малко по-млада при родителите на деца, които са затлъстели на 36 месеца (33,0 срещу 30,4) (Таблица 2).

Таблица 3 описва връзките между непрекъснатата степен на метилиране на децата при всеки CpG динуклеотид и детското затлъстяване на 36 месеца за 75 деца с последващи данни. Мултивариативният логистичен регресионен модел е коригиран за детски пол, изходна възраст, изходен ИТМ-Z и изходен ИТМ за възрастни. След отчитане на тези ковариати, по-високо метилиране на изходното ниво на cg01307483 (NRF1) е значително свързана с по-голяма вероятност от детско затлъстяване на 36 месеца (съотношение на шансовете = 2,98, 95% ДИ = [1,06, 8,38], стр = 0,04). PPARGC1B метилирането е потенциално свързано с намалено затлъстяване след 36 месеца, но не е статистически значимо. SORCS2 метилирането не е статистически значимо за cg03218460 или cg18431297 [30, 31].

В логистичния регресионен модел, анализиращ NRF1 динуклеотид, детски пол, изходна възраст на детето и изходен ИТМ на родител, не са били значими предиктори на детското затлъстяване на 36 месеца (Таблица 4). Въпреки това, в този модел, детски изходен BMI-Z и изходно диференциално метилиране на NRF1 бяха значими предиктори на детското затлъстяване на 36 месеца. Фигура 1 показва прогнозираната от модела вероятност за затлъстяване при деца при 36-месечно проследяване като функция на увеличаване NRF1 метилиране. Изходният BMI-Z за деца е важен предиктор във всички модели на CpG динуклеотид, освен в съотношението на шансовете = 3.09–4.08, стр Таблица 4 Асоциация на изходно диференциално метилиране на ДНК а със затлъстяване на 36 месеца, коригирано за ковариати

като

Моделна прогнозирана вероятност за детско затлъстяване при 36-месечно проследяване като функция на метилирането на NRF1. Фигура 1 показва прогнозираната от модела на логистична регресия вероятност за детско затлъстяване на 36 месеца като функция от степента на метилиране на cg01307483 (NRF1). Плътната линия показва прогнозираната вероятност, а сивата засенчена област представлява 95% доверителен интервал. Като степента на метилиране на NRF1 се увеличава, вероятността от детско затлъстяване на 36 месеца се увеличава значително

Дискусия

Доколкото ни е известно, това е първото проспективно кохортно проучване, което изследва метилирането на ДНК, събрано чрез слюнчени проби, като предиктор за възникващото затлъстяване в детска възраст сред 3-5-годишни испанци. Въпреки че други проучвания са изследвали моделите на метилиране на ДНК при деца, които вече са с наднормено тегло, нашето проспективно проучване изследва как тези модели могат да бъдат използвани за прогнозиране на бъдещата поява на затлъстяване при деца със затлъстяване в предучилищна възраст над и над предвиденото от тяхната възраст, пол, изходен ИТМ-Z и ИТМ на майка им. След коригиране за тези ковариати, изходно метилиране на Cg1307483 (NRF1) е значително свързана с възникващо детско затлъстяване при 36-месечно проследяване със значително положително съотношение на коефициентите (OR = 2,98, стр = 0,04). За да се постави това съотношение на шансовете в контекста и да се подобри интерпретацията, моделът изчислява 48% шанс за детско затлъстяване при 36-месечно проследяване за дете при 75-ия процентил от NRF1 метилиране срещу само 30% шанс за затлъстяване за подобно дете при 25-ия персентил.

В съответствие с други проучвания, по-висок изходен BMI-Z на детето през предучилищния период е свързан с появата на затлъстяване 3 години по-късно, но изходното метилиране на NRF1 е свързано с по-късно затлъстяване дори след корекция за изходен BMI-Z. NRF1 е свързан с вродения имунен отговор, регулиращ възпалението на адипоцитите и експресията на цитокини, както и термогенната адаптация на кафявата мастна тъкан. Той също така играе роля в инсулиновата резистентност [34,35,36]. Настоящите резултати се основават на съществуващата литература, като демонстрират, че ДНК метилирането на критичен CpG динуклеотид в NRF1 ген при 3-5-годишни деца с наднормено тегло е свързан с появата на затлъстяване 3 години по-късно. Това осигурява потенциална цел за по-нататъшно изследване и предполага, че възпалението на адипоцитите може вече да бъде засегнато преди фенотипната поява на детско затлъстяване при испаноязычни деца. Други проучвания показват, че ранните експозиции в живота могат да повлияят на по-късните резултати за здравето и заболяванията. Това разбиране на жизнения цикъл на възникващите фенотипове може да допринесе за здравните различия.

Важно е да се отбележи, че предишни проучвания са замесени NRF1 свързано със съществуващото затлъстяване и малките испанци, използващи също проби от кръв и скелетни мускули [36]. Comuzzie и колегите му изследват хромозома 7q при испанци и откриват уникални локуси, допринасящи за детското затлъстяване [33]. Както в нашето проучване, гените, свързани значително със затлъстяването, предполагат силно възпалително влияние. Въпреки че нашето проучване не потвърждава тази хипотеза, то предоставя допълнителни данни, подкрепящи тази теория. Защото NRF1 е основен транскрипционен фактор в метаболитната регулация и стимулира експресията на PPARGC1B, те изглеждат като обещаващи цели за по-нататъшни изследвания и интервенционни подходи. Въпреки че в настоящото проучване не могат да бъдат направени директни сравнения между слюнката и кръвта, фактът, че ние отбелязахме същата връзка в слюнката, каквато се намира в кръвта и скелетните мускули, допълнително подсилва подкрепата за използването на слюнката като полезна тъкан за епигенетично проучване.

Други гени също могат да играят важна роля както за предсказване на по-късно затлъстяване, така и за разбиране на пътищата, които водят до затлъстяване. Например, PPARGC1B метилирането има потенциално силна връзка с намалява затлъстяване на 36 месеца, но не е статистически значимо. PPARGC1B се свързва с окисляването на мазнините, неоксидативния метаболизъм на глюкозата и регулирането на енергията [37, 38]. по същия начин, SORCS2 метилирането, което функционира за регулиране на нивата на инсулин на гладно и секрецията на инсулин, е потенциално свързано с увеличен затлъстяване на 36 месеца, но не е статистически значимо в тази относително малка проба [31, 39]. Повторението на тази работа в по-голяма извадка е необходимо за по-нататъшно разбиране на тези и други епигенетични приноси за ранната поява на затлъстяване в популации, които изпитват по-високи здравни различия, свързани със затлъстяването. Освен това, въпреки че малкият размер на аналитичната извадка изключва анализа на умереността в настоящото проучване, за бъдещите изследвания би било интересно да се проучи дали потенциалните връзки между метилирането и последващото състояние на затлъстяване зависят от първоначалния статус на ИТМ или други потенциални модератори от интерес (напр. Пол, етническа принадлежност, доходи и др.).

Към днешна дата много епигенетични изследвания се фокусират върху изследването на молекулярните пътища. Въпреки че все още не е известно дали тези модели на метилиране на ДНК могат да бъдат използвани като биомаркери, нашето проучване предоставя доказателство за принцип, демонстриращо, че дори при деца със затлъстяване испанци някои диференцирани модели на метилиране са свързани с по-късната поява на затлъстяване. Въпреки че е ясно, че податливостта към затлъстяване в „обезогенна“ среда варира при отделните индивиди, не е ясно защо. Тази линия на епигенетично изследване, използващо слюнката като достъпна тъкан за педиатрично проучване, обещава насоки за по-нататъшно изследване както за разбиране, така и за намеса преди появата на детското затлъстяване.

Макар че NFR1 е значително свързана със затлъстяването при деца при 36-месечно проследяване, сравнително малкият размер на пробата, анализиран в това проучване, може да е допринесъл за неуспех да се открият важни връзки за другите CpG динуклеотиди. Разширяването на настоящия анализ, за ​​да включи по-големи размери на пробата, би помогнало да се потвърдят и валидират констатациите. Въпреки че съществува строг протокол за събиране на слюнката, замърсяване и грешка при събиране на хора са възможни при събиране на слюнчената ДНК. Въпреки че предишната литература показва, че метилирането на ДНК в слюнката и кръвните проби са сходни, настоящото проучване изследва само моделите на метилиране в слюнката и не може да се използва за директно сравнение с кръвта. Освен това, въпреки че тази проба дава представа за испаноядците на 3-5 години, моделите на метилиране на ДНК трябва да бъдат изследвани при деца от различни възрасти и раса/етническа принадлежност.

Заключения

Слюнката предлага неинвазивно средство за събиране на ДНК и епигенетичен анализ. Това доказателство за основното проучване предоставя емпирични доказателства, подкрепящи идеята, че ДНК метилирането, оценено с помощта на слюнчената тъкан, събрана при деца, които не са със затлъстяване, може да се използва като важен предиктор за детското затлъстяване 3 години по-късно. NFR1 може да бъде цел за по-нататъшно изследване на затлъстяването при испаноязычни деца.