Хидролизираните чревни липиди предизвикват ситост и засищане.

съставът

Подгрупата на жлъчните киселини, които са 12α-хидроксилирани, се синтезират с по-висока скорост при затлъстяване и инсулинова резистентност.

Изтривайки Cyp8b1, ензимът, необходим за производството на 12α-хидроксилирани жлъчни киселини, влошава чревната абсорбция на липиди при мишки.

Какви са новите открития?

Намаляването на 12α-хидроксилирани жлъчни киселини при мишки забавя липидната хидролиза и позволява липиден достъп до долните черва, което забавя изпразването на стомаха и намалява приема на храна.

Рецепторът за мазнини GPR119 посредничи по този път на липидно усещане.

Ефектите от този път върху изпразването на стомаха изискват непокътната сигнализация чрез чревните хормони GLP-1 и PYY.

Как може да се отрази на клиничната практика в обозримо бъдеще?

Инхибирането на Cyp8b1 е потенциална цел за лечение на затлъстяване и диабет.

Въведение

Жлъчните киселини (BAs) емулгират диетичните липиди, което му позволява ефективно да се хидролизира и абсорбира в проксималното черво. Данни от мишки показват, че сред ендогенните видове BA тази абсорбционна функция на липидите се осъществява най-ефективно от холевата киселина (CA) .10-13 Ние разсъдихме, че съставът на ендогенните BAs определя дали мазнините се абсорбират ефективно в горната част на тънките черва или дали неабсорбирани липидни видове, като 2-MAG, навлизат в дисталното черво, където могат да активират ентероендокринната клетъчна индукция на насищане. BA също имат алостерична функция, при която те могат да се свържат в джоба за свързване на субстрата и да стабилизират активността на ензима N-ацил фосфатидилетаноламин фосфолипаза D (NAPE-PLD), който произвежда регулиращи апетита липидни медиатори като OEA и арахидонолиетаноламид (AEA) .14 15 Тази стабилизираща функция се осъществява най-ефективно от дезоксихолевата киселина (DCA). По този начин БА могат да допринесат за чревното липидно усещане по множество начини, но техните роли не са напълно определени.

Други и по-рано съобщавахме, че мишките, които нямат 12α-хидроксилаза Cyp8b1, нямат намаление на общите нива на BAs, но променен състав на BA, с липса на 12α-хидроксилирани BAs CA и DCA и техните конюгирани форми. Тези мишки също имат нарушена абсорбция на диетичен холестерол и триглицериди.10-13 Тъй като мишките Cyp8b1 -/- имат нормални общи нива на BAs, това увреждане на липидната абсорбция се дължи на липсата на 12α-хидроксилирани (12-OH) BAs и неефективност на останалите не-12-OH BAs за насърчаване на липидната абсорбция. 12-OH BAs включват CA, DCA и техните конюгати; не-12-OH BA включват мурихолови киселини (MCAs), хенодеоксихолова киселина (CDCA) и техните конюгати. Последицата от това увреждане е, че малко количество хранителни мазнини преминава по цялата дължина на стомашно-чревния тракт, като в крайна сметка се появява във фекалиите. Ние разсъждавахме, че мишките Cyp8b1 -/- може да са нов инструмент за (1) дисекция на ролята (ите) на BA върху чревния липиден сензор и (2) да изследват относителния принос на различни чревни липидни сензорни пътища върху приема на храна.

Материали и методи

Експерименти с животни

Мишките Cyp8b1 -/- и GPR119 -/- са на генетичен фон C57BL/6 (Taconic # 11784 и # TF1293). Прекосихме мишки Cyp8b1 -/- с мишки GPR119 -/-, за да получим двойни нокаутиращи мишки и използвахме за експерименти мъжки мишки на възраст между 8 и 15 седмици. Мишките бяха хранени с нормална диета с чау (3,4 kcal/g, Purina 5053, 24,7% kcal от протеини, 62,1% въглехидрати и 13,2% мазнини), диета без мазнини (3,3 kcal/g, Envigo TD 03314, 24,2% kcal от протеини и 75,8% от въглехидрати) или диета с високо съдържание на мазнини (5,21 kcal/g, Research Diets D12492, 20,0% kcal от протеини, 20,0% въглехидрати и 60,0% мазнини). Мишките бяха снабдени с диета и вода ad libitum и се поддържаха в 12-часов цикъл светлина/тъмнина, включен със светлини в 7:00. За измерване на приема на храна, мишките бяха настанени индивидуално, а дозаторът за храна беше разположен вътре в клетката.

Допълнителен материал

Статистика

Резултатите са представени като средна стойност ± SEM. Данните бяха анализирани чрез еднопосочен и двупосочен ANOVA с тест за множество сравнения на Tukey или t-тест на Student.

Резултати

Намаленият прием на храна предизвиква ниско телесно тегло на мишки Cyp8b1 -/-

Cyp8b1 -/- мишки, поддържани на стандартна чау диета, показват a

10% намаление на телесното тегло в сравнение с мишки от див тип (WT), което се дължи на малки, но статистически значими намаления както на затлъстяване, така и на чиста маса (фигура 1A-F) .10 11 13 Ad libitum chow прием на Cyp8b1 -/- мишки е леко намален (фигура 1G) спрямо WT контролите. Експериментите с непряка калориметрия не показват разлики в съотношението на дихателния обмен, консумацията на кислород, производството на топлина или активността между генотипите (допълнителна онлайн фигура 1A-D). За да проверим дали това ниво на прием на храна е достатъчно, за да индуцира ниското телесно тегло на мишки Cyp8b1 -/-, направихме експеримент за хранене по двойки. Телесното тегло на двойки WT мишки намалява до нивото на мишки Cyp8b1 -/- (фигура 1Н). Взети заедно, тези данни подкрепят предположението, че намаленият прием на храна е допринесъл за по-ниското телесно тегло на мишки Cyp8b1 -/-. Съответно след това изследвахме предполагаемите механизми, лежащи в основата на този намален прием на храна при мишки Cyp8b1 -/-.

Допълнителен материал

Експеримент с телесно тегло, масов състав и хранене по двойки при мишки WT и Cyp8b1 -/-. (А) Телесно тегло на мишки, хранени с диу чау (n = 8 за всяка група). ** p -/-, # p ## p -/- мишки, ние измервахме продуктите му в йеюнална и хипоталамусна тъкан в 16-часово гладуване и 5-часово повторно състояние. В еюналния епител не открихме разлики между генотипите в AEA, докозахексаеноил етаноламид (DHEA), 2-арахидонил глицерол (2-AG) или докозахексаеноилглицерол (DHG) (фигура 2B-E). Въпреки това, силната индукция на OEA след повторно хранене при WT мишки беше значително притъпена при мишки Cyp8b1 -/- (фигура 2А). Тези данни са в съответствие с констатацията, че DCA, 12-OH BA, е по-добър от други видове BA при насърчаване на активирането на NAPE-PLD.

Ефекти от гладуването и храненето върху етаноламидите на мастните киселини и канабиноидите в чревното черво и хипоталамуса. Ефект от 16-часово лишаване от храна (Бързо) и 5-часово подхранване (Refed) върху нивата на OEA (A, F), AEA (B, G), DHEA (C, H), 2-AG (D, I ) и DHG (E, J) в йеюнума (A – E) и хипоталамуса (F – J) (n = 4 за всяка група). * p -/- мишките показаха значително намален размер на хранене (допълнителна онлайн фигура 3А). Няма обаче разлика в продължителността на хранене, честотата или интервала след хранене (допълнителна онлайн фигура 3B – D). Като цяло тези данни не подкрепят ролята на OEA-PPARα – пътя на ситост в хипофагията на мишки Cyp8b1 -/-.

Допълнителен материал

Допълнителен материал

Нарушената диетична абсорбция на триглицериди при мишки Cyp8b1 -/- се дължи на нарушена хидролиза

Абсорбция на хидролизирани липиди. Плазмени дезинтеграции в минута (DPM), получени от (A) [3 H] -2-олеоил глицерол (2-OG) и (B) [14 C] -олеинова киселина в WT и Cyp8b1 -/- мишки (n = 5 за всяка група).

Диетичните мазнини предизвикват бавно изпразване на стомаха и нисък прием на храна при мишки Cyp8b1 -/-

Липидите в долната част на тънките черва потискат приема на храна, като забавят изпразването на стомаха и предизвикват стомашно раздуване и засищане. По този начин тествахме хипотезата, че нарушената липидна абсорбция на дефицит на Cyp8b1 причинява бавно изпразване на стомаха, като по този начин намалява приема на храна.

За да оценим изпразването на стомаха, използвахме два метода. За да измерим изпразването на стомаха в твърда фаза, гладувахме мишките в продължение на 16 часа, след това им разрешихме достъп до чау за 1 час, след което отстранихме храната за 2 часа преди събирането на тъкани. Измерихме индивидуалния прием на храна и съдържанието на стомаха, за да определим процента на изядената храна, която се е изпразнила от стомаха. За отбелязване е, че по време на тези експерименти ние установихме, че „презареденият“ прием на храна не се различава между генотипите по време на 1-часовия период на хранене след продължително (16 часа) гладуване (0,54 ± 0,02 срещу 0,45 ± 0,05 g за контрола и Cyp8b1 -/-, съответно p = 0,17). Изпразването на стомаха в течна фаза се оценява чрез абсорбция на ацетаминофен23 след течно хранене (Уверете се: царевично масло, 17: 3). И двата теста показаха, че дефицитът на Cyp8b1 нарушава изпразването на стомаха (фигура 4A-B).

Допълнителен материал

Диетичните мазнини също са били необходими и достатъчни за хипофагията на мишки Cyp8b1 -/-. По време на диетично хранене без мазнини, кумулативният прием на храна в продължение на 7 дни при мишки Cyp8b1 -/- в сравнение с WT вече не е намалявал; ако нещо, то е било леко увеличено в някои моменти (фигура 4D). Съобщава се, че мишките Cyp8b1 -/- хранени с високомаслена диета в продължение на няколко седмици нямат разлики в приема на храна10; обаче е известно, че ефектите на чревните липиди върху потискането на приема на храна след хронична липидна стимулация.24–26 За да проверим дали делецията на Cyp8b1 влияе върху приема на диети с високо съдържание на мазнини в краткосрочен план, дадохме на мишки диета с високо съдържание на мазнини (60% калории от мазнини) за 1 ден. Диетата с високо съдържание на мазнини от мишки Cyp8b1 -/- беше значително намалена (приблизително 30% намаление) в сравнение с WT мишки (фигура 4Е). Тези данни потвърждават, че мишките Cyp8b1 -/- имат намалено хранене в зависимост от диетата при изпразване на стомаха и това е свързано с индуцирано насищане.

Gpr119 е необходим за фенотипи на стомашното изпразване и прием на храна при мишки Cyp8b1 -/-

Сензорът за мазнини GPR119 е обогатен с ентероендокринни клетки на илеума и дебелото черво, 7 27, особено L клетки, 28 и се съобщава, че медиира индуцирана от мазнини секреция на GLP-1, въз основа на хранителни експерименти при хора.9 Активирането на чревния GPR119 забавя стомаха изпразване чрез зависими от чревния хормон и механизми, независими от чревния хормон.7 29 В съответствие с предходни данни, 8 28 открихме, че GPR119 се изразява главно в дисталното тънко черво и дебелото черво (фигура 5А). Въпреки това, няма разлика в експресията на иРНК на Gpr119 между Cyp8b1 -/- и контролни мишки (фигура 5В). Ние предположихме, че дефицитът на Cyp8b1 предизвиква бавно изпразване на стомаха чрез активиране, а не експресия на GPR119.

Допълнителен материал

За отбелязване е, че не наблюдавахме никакви разлики в изпразването на стомаха, приема на храна, телесното тегло или телесния състав при мишки с еднократен нокаут на GPR119 в сравнение с контролите на WT (фигура 5C-K). Това е в съответствие с публикуваните данни 33 и с концепцията, че при нормални условия GPR119 е необходим за тези функции. Вместо това, нашите данни подкрепят идеята, че GPR119 се активира в Cyp8b1 -/- поради нарушената им липидна абсорбция, осигурявайки лиганди, които обикновено няма достъп до GPR119 в дисталното черво.

Ileal GLP-1 и PYY допринасят за бавното изпразване на стомаха при мишки Cyp8b1 -/-

Добре установено е, че GLP-1 намалява изпразването на стомаха и телесното тегло.34 GPR119 медиира секрецията на GLP-1 и PYY и двата хормона намаляват изпразването на стомаха.7 Освен това системните нива на GLP-1 в плазмата се повишават след орално измерване на глюкоза в независимо генерирана линия от мишки Cyp8b1 -/- 11. По този начин може да се предскаже GLP-1 и/или PYY да медиират ефектите на Cyp8b1 -/- върху изпразването на стомаха.

За да изследваме това, използвахме фармакологични антагонисти на рецепторите (експерименталната схема е показана на фигура 6А). Интраперитонеалното инжектиране на GLP-1 рецепторния антагонист екзендин-9 (0,3 mg/kg) успешно повишава нивата на глюкоза в плазмата при всички лекувани мишки, като по този начин се потвърждава дозата на екзендин-9 (фигура 6В). Това лечение обаче не обърна бавното изпразване на стомаха при мишки Cyp8b1 -/- (фигура 6С). Интраперитонеалното инжектиране на PYY Y2 рецепторния антагонист BIIE (2 mg/kg) не променя нивата на плазмената глюкоза или нормализира бавното изпразване на стомаха при мишки Cyp8b1 -/- (фигура 6D-E). За да потвърдим дозата си от BIIE, ние оценихме индуцирания от фекалния номер на пелета 5-хидокситриптофан (5-HTP), тъй като PYY потиска индуцираната от 5-HTP дефекация.35 Експерименталният график е показан на допълнителна онлайн фигура 6А. В този експеримент лечението с 5-HTP увеличава броя на пелетите във фекалиите и това се потиска от даването на храна (Уверете се: царевично масло, 17: 3). Това потискане беше успешно обърнато от BIIE (2 mg/kg) (допълнителна онлайн фигура 6B), като по този начин се потвърди, че тази доза BIIE блокира PYY сигнализирането. Следователно, ние успешно инхибирахме GLP-1 и PYY сигнализирането, но индивидуалната блокада на тези хормонални сигнални пътища не обърна фенотипа на изпразване на стомаха на мишки Cyp8b1 -/-.

Допълнителен материал

Нива на GLP-1 и PYY и принос на GLP-1 и Y2 рецепторите за изпразването на стомаха. (A) Експериментална схема за GLP-1 рецепторен антагонист exendin-9 (EX-9) и Y2 рецепторен антагонист (BIIE). Exendin-9 (EX9, 0.3 mg/kg, ip) или BIIE (2 mg/kg, ip) се дават на мишките 30 минути преди сока, богат на мазнини, осигурете: царевично масло (17: 3), след това 1 час по-късно, ацетаминофен (100 mg/kg) се дава чрез орален сондаж. Кръвни проби бяха събрани 15 минути след ацетаминофен сонда. (B – E) Ефект на GLP-1 рецепторен антагонист и Y2 рецепторен антагонист върху изпразването на стомаха в течна фаза (WT, n = 5–8; Cyp8b1 -/-, n = 4–6). * p -/-, n = 6). * p -/-, n = 8–10; GPR119 -/-, n = 14–20; DKO, n = 7–9). ** p -/- мишки, прилагахме както екзендин-9, така и BIIE, за да блокираме едновременно GLP-1 и Y2 рецепторите. Комбинираното лечение с антагонисти нормализира бавното изпразване на стомаха при мишки Cyp8b1 -/- (фигура 6F, G). Тези данни показват, че както GLP-1, така и PYY играят решаваща роля при изпразването на стомаха при мишки Cyp8b1 -/-.

След това изследвахме нивата на GLP-1 и PYY. Събрахме мукозния слой на илеалната тъкан при същите условия като теста за твърдо изпразване на стомаха (16-часово бързо, 1-часово хранене с чау, 2-часово лишаване от храна, след това събиране на тъкани). Наблюдавахме значително увеличение на GLP-1 и PYY в чревната тъкан на мишки Cyp8b1 -/- и това беше напълно обърнато при DKO мишки (фигура 6Н, J). Неочаквано не наблюдавахме значителни разлики между генотиповете в системна плазма GLP-1 или PYY (фигура 6I, К). Също така, няма разлика в плазмените GLP-1 и PYY след течно хранене (Уверете се: царевично масло, 17: 3) или след инфузия на зехтин чрез хронични постоянни дуоденални катетри (допълнителна онлайн фигура 7A-F). Това може да се дължи на бързото разграждане на тези хормони в плазмата. Не открихме разлики в плазмените нива на няколко други стомашно-чревни хормони, включително GIP, грелин и GDF15 (допълнителна онлайн фигура 8). Тези данни предполагат, че нивата на GLP-1 и PYY локално в червата са повишени при мишки Cyp8b1 -/- и това изисква GPR119.

Допълнителен материал

Допълнителен материал

Non-12-OH BA CDCA уврежда абсорбцията на липиди и забавя изпразването на стомаха при WT мишки

Предвидихме, че нарушеното изпразване на стомаха на мишки Cyp8b1 -/- е вторично спрямо променения състав на BA и последващото увреждане на абсорбцията на липиди в горната част на червата. За да тестваме това, направихме орална сонда на CA (основната BA, липсваща от мишки Cyp8b1 -/-) в продължение на 4 дни. Това беше достатъчно за нормализиране на абсорбцията на липиди и бавното изпразване на стомаха при мишки Cyp8b1 -/- (фигура 7А, В). Това показва, че промененият състав на BA е ключовият аспект на мишките Cyp8b1 -/-, който е отговорен за нарушеното изпразване на стомаха.

Дискусия

В това проучване показахме, че промяната на състава на BA чрез аблация на Cyp8b1 индуцира промени в два чревни липидни пътища: (1) нарушено производство на OEA след повторно хранене в йеюнума и (2) бавно изпразване на стомаха и повишено засищане, които се обръщат след съпътстващ GPR119 нокаут . Тези констатации показват, че (3) засилената сигнализация на GPR119 може да замени намаляването на йеюналната OEA и че (4) BAs влияят на GPR119-зависимото чревно усещане за мазнини и играят роля като регулатори на приема на храна.

Наличието на хранителни мазнини в долната част на тънките черва предизвиква бавно изпразване и засищане на стомаха. Предполагаме, че неефективната интралуминална хидролиза на триглицериди при мишки Cyp8b1 -/- позволява навлизането на неусвоен липид в долната част на червата и дебелото черво, както се вижда от факта, че малко количество неабсорбиран липид достига до фекалиите. Това осъществява достъп и активира GPR119, за да индуцира GLP-1 и PYY, които забавят изпразването на стомаха и намаляват приема на храна (фигура 7Е).

Нашата работа предполага, че когато диетичната абсорбция на липиди е хронично нарушена, пътят GPR119 се активира хронично от физиологични лиганди. Кои липидни видове са отговорни за това? Въпреки че OEA може да активира GPR119 с EC50 от 0,2–4,4 µM, 7 това е малко вероятно да обясни фенотипа на мишки Cyp8b1 -/-, тъй като нивата на OEA в червата са по-ниски при мишки Cyp8b1 -/-. Въпреки това, множество други липидни видове също могат да активират GPR119, с EC50s в същия ред на величина, включително 2-MAG като 2-OG.7 2-MAG е в изобилие след хранене, защото е основен продукт от диетичната хидролиза на триглицеридите. Освен това, нашето предишно изследване на липидомиката идентифицира по-високи нива на MAG във фекалиите на мишки Cyp8b1 -/-, демонстрирайки, че излишъкът е достъпен за долните им черва. По този начин предсказваме, че 2-MAG е активаторът на GPR119 в мишки Cyp8b1 -/-.

Механизмите на насищане в стомашно-чревния тракт са сложно регулирани от чревните хормони. Чревните хормони се освобождават от клетките в стомашно-чревния тракт, но секрецията на GLP-1 и PYY в отговор на GPR119 се обогатява в долната част на червата, където експресията на GPR119 е най-висока. Flock et al показват, че ефектът на фармакологичен агонист на GPR119 за забавяне на изпразването на стомаха не може да бъде обърнат нито с антагонист на Y2 рецептор, нито с аблация на GLP-1 рецептор.29 След операция на стомашен байпас на Roux-en-Y, единична блокада на GLP-1 или PYY сигнализирането няма ефект върху приема на храна, но инхибирането на двата сигнални пътища увеличава приема на храна.41 Това предполага, че множество чревни хормони регулират изпразването на стомаха и приема на храна. В съгласие с тези доклади, лечението с екзендин-9 или BIIE не нормализира бавното изпразване на стомаха на мишки Cyp8b1 -/-, но комбинираното лечение обръща този фенотип. По този начин, нашите данни показват, че понижаването на 12-OH BAs подобрява сигнализирането на GLP-1 и PYY чрез активиране на GPR119 в долната част на червата, за да забави скоростта на изпразване на стомаха.

Използвахме мишки Cyp8b1 -/- като инструмент за разбиране на приноса на BA-зависимия чревен метаболизъм на липидите върху изпразването и засищането на стомаха. Това проучване разкрива, че ефектът на BAs за насърчаване на ефективна хидролиза и усвояване на хранителните мазнини е ендогенен механизъм, който предотвратява ентероендокринното клетъчно насищане. Дали тази конкретна промяна в състава на BA - намаляване на 12-OH BAs и увеличаване на не-12-OH BA - ще причини подобни промени при хората? Нашите данни показват, че изобилието от CDCA, основният не-12-OH BA при хората, е достатъчно, за да наруши абсорбцията на липиди и бавното изпразване на стомаха при WT мишки. Ще бъдат необходими допълнителни експерименти, за да се тества напълно това. Въпреки това е изкушаващо да се предположи, че преференциалният синтез на 12-OH BAs по време на инсулинова резистентност при хора42-44 може да намали чревното липидно усещане. И обратно, възможно е терапевтичните промени в състава на ВА да поддържат хронично, ниско ниво на активиране на ендогенни чревни липидни пътища за лечение на затлъстяване и диабет.

Благодарности

Авторите биха искали да признаят Рудолф Лайбел, Енрико Бертаджа и Анна Чен за полезни дискусии и Томас Колар за техническа помощ.