Карин Г. Стенкула

1 Транспорт на глюкоза и трафик на протеини, Катедра по експериментални медицински науки, BMC, Lund University, 221 84 Lund, Швеция

Ева-Лена Стенблом

2 Контрол на апетита, Катедра по експериментални медицински науки, BMC, Lund University, 221 84 Lund, Швеция

Каролин Монтелий

2 Контрол на апетита, Катедра по експериментални медицински науки, BMC, Lund University, 221 84 Lund, Швеция

Емил Егециоглу

2 Контрол на апетита, Катедра по експериментални медицински науки, BMC, Lund University, 221 84 Lund, Швеция

Шарлот Ерлансон-Албертсон

2 Контрол на апетита, Катедра по експериментални медицински науки, BMC, Lund University, 221 84 Lund, Швеция

Свързани данни

Моля, свържете се с автора за искания за данни.

Резюме

Заден план

Диетичните тилакоиди, получени от спанак, имат благоприятен ефект върху натрупването на мазнини в тялото и липидите в кръвта, както е показано при хора и гризачи. Установените важни механизми включват забавено храносмилане на мазнини в червата, без да причиняват стеаторея и повишено окисление на мастните киселини в чревните клетки. Целта на нашето проучване беше да се изясни дали повишената екскреция на фекални мазнини е важен механизъм за нормализиране на метаболизма на мастната тъкан по време на хранене с високо съдържание на мазнини при мишки, допълнени с тилакоиди.

Методи

Мишките бяха рандомизирани да получават HFD или тилHFD в продължение на 14 дни (n = 14 за контролната група и 16 за групата на тилакоидите). Ефектът на тилакоидите върху разпределението на телесните мазнини, съдържанието на мазнини във фекалиите и черния дроб и метаболизма на мастната тъкан е изследван след хранене с високо съдържание на мазнини.

Резултати

Добавянето на тилакоид в продължение на 14 дни причинява повишено съдържание на мазнини във фекалиите без компенсаторно хранене в сравнение с контрола. В резултат на това, лекуваните с тилакоиди животни са имали намалени депа на мастна маса и намалено натрупване на мазнини в черния дроб в сравнение с контрола. Разпределението на размера на адипоцитите, изолирани от висцералната мастна тъкан, беше стеснено и размерът на клетките намаля. Адипоцитите, изолирани от мишки, третирани с тилакоиди, показват значително повишена липогенеза и експресията на протеин на активирания от пероксизома пролифератор гама (PPARγ), целевата FAS надолу по веригата, както и коактиваторите на транскрипционен фактор PGC1-α и LPIN-1 са регулирани в мастна тъкан тъкан от мишки, хранени с тилакоиди.

Заключения

Заедно тези данни предполагат, че добавките с тилакоиди намаляват телесните мазнини и размера на мастните клетки, като се свързват с хранителната мазнина и увеличават нейната фекална екскреция, като по този начин намаляват хранителните мазнини, налични за усвояване.

Заден план

Затлъстяването се характеризира с излишна мастна маса поради хроничен дисбаланс между енергийния прием и енергийните разходи. Няколко съпътстващи заболявания са свързани със затлъстяването, като диабет, сърдечно-съдови заболявания и неалкохолна мастно-чернодробна болест (NAFLD). Тези съпътстващи заболявания се увеличават с широко разпространение, подчертавайки спешната нужда от стратегии за предотвратяване на възникващата глобална епидемия [1].

Претоварването с енергия под формата на хранителни мазнини играе съществена роля за насърчаване на затлъстяването в сравнение с протеините и въглехидратите [2]. Следователно загуба на тегло може да бъде постигната чрез намаляване на консумацията на мазнини или усвояването на мазнини. Инхибиторите на липазата са ефективни при намаляване на телесното тегло, но често с очевидни стомашно-чревни странични ефекти като стеаторея [3].

В настоящото изследване се интересувахме от разбирането на механизма на действие за намаляване на мастната маса на ниво мастна клетка след добавяне на тилакоиди, като се фокусирахме върху метаболизма и разпределението на клетките по размер на адипоцитите [14]. Ние също се интересувахме да разберем дали има отделяне на фекални мазнини, което не е стеаторея в пълен мащаб. За тази цел мишките бяха хранени с високо съдържание на мазнини в продължение на две седмици и метаболизмът на адипоцитите беше изследван, както и екскрецията на фекални мазнини.

Методи

Животни

В проучването са използвани десет до дванадесет седмични мъжки мишки C57Bl6 (Taconic, Дания) с тегло приблизително 24-26 g при пристигане. Животните бяха настанени в помещения, поддържани на 12/12-часов цикъл светлина/тъмнина с включени светлини в 07:00 при стабилни условия. Мишките имаха свободен достъп до стандартна чау (R3, Lantmännen, Vadstena, Швеция) и чешмяна вода до началото на експериментите.

Материал

PPARγ, LPIN-1, FAS и PGC-1α антитела са от Cell Signal Technology (Денвърс, САЩ), β-актиновите антитела са от Sigma (Стокхолм, Швеция).

Тилакоиди и диети

Използваните в изследването тилакоиди със зелени растения, съдържащи хлорофил, са приготвени от спаначени листа, както е описано по-рано [15], последвано от барабанно изсушаване. 100 g тилакоиди съдържат 23,5 g протеин, 11,9 g мазнини, 41,7 g въглехидрати, 0,27 g натрий, 2,0 g хлорофил, 27,9 mg лутеин, 0,7 mg зеаксантин, 4,8 mg бета-каротин, 0,021 mg витамин А, 1,3 mg витамин К, 6,0 mg витамин Е и 0,17 mg фолиева киселина.

В експериментите се използва диета с високо съдържание на мазнини (HFD) и обогатена с изоларичен тилакоид HFD (thylHFD). Диетите са проектирани да имат един и същ състав на макроелементите и енергийното разпределение на 46 E% мазнини, 18 E% протеини и 36 E% въглехидрати. Диетите се основават на диетата D12451 с високо съдържание на мазнини от Research Diets (Research Diets®, New Brunswick, NJ, USA). ThylHFD съдържа 33% тегл./Тегл. Екстракт от тилакоид (Appethyl®, Greenleaf Medical AB, Стокхолм, Швеция), което е сравнимо с предишни проучвания при плъхове, които демонстрират ефекти върху телесното тегло и приема на храна [5–7].

Експериментална процедура

След пристигането си в съоръжението за животни мишките бяха настанени на две и две и бяха аклиматизирани в съоръженията за минимум 7 дни преди началото на експериментите. Мишките бяха рандомизирани на базата на телесно тегло, за да получат HFD или thylHFD в продължение на 14 дни (n = 14 за контролната група и 16 за тилакоидната група). Нова храна се прилага два пъти седмично и се наблюдава консумацията на храна. Телесното тегло беше измерено на ден 0 (изходно ниво), ден 7 и в края на проучването на ден 14. Мишките след това бяха евтаназирани и подложки на черния дроб и телесните мазнини бяха разрязани и претеглени и взети биопсии на мастна тъкан за in vitro анализ на първични адипоцити.

Двуенергийна рентгенова абсорбциометрия (DEXA)

За измерване на общия телесен състав (обща чиста маса и мастна маса), DEXA е извършен на подгрупа от животни (n = 6 и 9 за HFD и съответно thylHFD групи), използвайки сканирането Lunar PIXImus2 ™ DEXA (GE Healthcare, WI, САЩ).

Съдържание на фекални мазнини

Фекалните проби бяха събрани от мишки (n = 14 (контрола) и 16 (тилакоид)) през последните 8 дни от двуседмичния период и изсушени за по-късен анализ. Пробите от фекалии са анализирани за съдържание на мазнини с помощта на киселинна хидролиза (лаборатория за тестване на храни и фуражи Eurofins, Linköping, Швеция).

Анализ на чернодробен триацилглицерол (TG)

Замразените чернодробни тъкани се хомогенизират 1: 4 в 50 mM Tris – HCl рН 7,5, 1 mM EGTA, 1 mM EDTA, 0,27 M захароза, 5% NP-40, 1 mM дитиотреитол (DTT) и пълен инхибитор на протеаза и фосфатаза. Пробите се подават в цикъл на нагряване (85 ° С за 5 минути, стайна температура за 10 минути и 85 ° С за 5 минути) и центрофугиране при 16000 xg за 2 минути. Супернатантът се анализира с използване на Infinity TG Liquide Stable Reagent (Thermo Scientific, САЩ).

Разпределение на размера на клетката

мазнини

маса 1

Въздействие на диетата с високо съдържание на мазнини със или без тилакоиди върху приема на храна и отделянето на липиди

Контролирайте диетата с HFD Тилакоид HFD
Прием на храна (g/ден)3,60 (3,52–3,84)3,72 (3,44–3,87)
Калоричен прием (kcal/ден)16,76 (16,41–17,91)16.05 (14.88–16.71) a
Общо съдържание на липиди във фекалиите (mg/ден)9,60 (8,69–10,42)22,73 (19,25–25,37) б

а-б Липогенеза в базалната (нестимулирана) а и стимулирани с инсулин (28 nM) б състояния в епидидимни и мезентериални адипоцити от мишки, хранени с HFD срещу ThylHFD за две седмици. Баровете представляват среден и интерквартилен диапазон. Статистическа разлика от p 5a) и клетъчна популация от по-големи клетки, така наречените големи клетки, вдясно от надира. В групата на HFD големите клетки са с различен размер между 50-150 μm диаметър, със среден размер на клетките 90 μm (Фиг. 5b). При третираните с тилакоиди животни разпределението на размера на клетките беше значително изместено наляво и по-стеснено, като големите клетки варираха между 30–100 μm и намален среден размер на клетките (

83 μm) (фиг. 5б). Като цяло разпределението на размера на клетките на мишки, хранени с thylHFD, е сравним с кривата на разпределение от мишки, хранени с чау, докладвани по-рано [12] (Фиг. 5а).

а-д Количествено определяне на Western blot анализ на PPARγ а, PGC1-α б, LPIN-1 (фиг. ° С) и FAS д в WAT (n = 5 животни/група). за нормализиране е използван β-актин. Western blot изображения, показани в д. Баровете представляват среден и интерквартилен диапазон. Статистическа разлика от p 1), която предполага други функционални свойства на тилакоидните мембрани за стабилизиране на телесното тегло. Такива свойства могат да бъдат повишено освобождаване на хормони на ситост като CCK и GLP-1, както се наблюдава при гризачи [6] и при хора [25, 26]. Повишеното освобождаване на хормоните на ситостта предполага забавено усвояване на хранителните вещества от червата по време на храносмилането през тилакоидните мембрани. В предишни публикации не сме открили доказателства за повишено отделяне на мазнини с фекалии чрез добавяне на тилакоиди въпреки телесното тегло и загубата на мастна маса, нито при човека [9], нито при плъхове [7]. Обогатената с тилакоиди диета с високо съдържание на мазнини, използвана при мишки, е същата като предишната за плъхове, което предполага видова разлика. При плъховете липсата на мазнини във фекалиите може да се дължи на по-бавно преминаване на храна през червата [9], което дава възможност за повишено окисление на мастните киселини в червата [10] и/или по-пълно усвояване на мазнините.

Намалената абсорбция на мазнини, дължаща се на добавката на тилакоид, както е намерена тук, намалена мастна маса и също така промени разпределението на размера на мастните клетки (вариращо между 30–100 μm при животни, хранени с високо съдържание на мазнини, в сравнение с 50–150 μm при контролно високо -мастно хранени животни (фиг. 5). Всъщност размерът на адипоцитите прилича на измерения при мишки, хранени с диета с ниско съдържание на мазнини (фиг. 5). Успоредно с това наблюдаваме при хранени с тилакоиди животни наблюдавано повишаване на регулацията на PPARγ, неговата целева FAS надолу по веригата и на PGC-1γ и LPIN-1, ядрени транскрипционни коактиватори на PPAR, които стимулират диференциацията на нови адипоцитни прекурсори и насърчават липогенезата [27]. В нашето изследване не можахме да определим активността на ядрената рецептор PPARγ, в подкрепа на това, че повишената протеинова експресия означава и повишена активност.Ми предполагаме, че добавките с тилакоиди могат да стимулират съхранението на липиди в малки клетки чрез набиране на прекурсори (хиперплазия), вместо да разширяват вече големи клетки (хипер rtrophia). Това е важно, тъй като уголемените клетки са свързани с възпаление и нарушена метаболитна хомеостаза.

Повишен капацитет за съхранение на базални липиди се наблюдава както при мезентериални, така и при епидидимни адипоцити, изолирани от мишки, хранени с тилакоиди (Фиг. 4). По този начин, повишената експресия на PPARy, PGC-1α и LPIN-1 заедно с профила на разпределение и повишената експресия на ензима FAS, който е от основно значение за липидния метаболизъм, подкрепят хипотезата за повишено набиране на метаболитно активни прекурсори на адипоцити, което може да обясни намалена мастна маса дори при повишена липогенеза. Изследванията са идентифицирали няколко естествени агонисти за PPARγ, като биоактивните съединения са растителни антиоксиданти като лутеолин, кверцитин, катехин и ресвератрол [28]. Тилакоидите съдържат антиоксиданти в големи количества, като лутеин, каротеноиди и зеаксантин. Следователно, ние също така предполагаме, че тези антиоксиданти могат да бъдат отговорни за взаимодействието със системата PPARγ.

В това проучване мишките, хранени с ThylHFD, също натрупват по-малко мазнини в черния дроб в сравнение с мишките, хранени с HFD. По-ранни проучвания демонстрират намалени нива на триацилглицерол в кръвта от тилакоидите [4, 6], но за първи път наблюдаваме намаляване на натрупването на мазнини в черния дроб. Това откритие може да е от клинично значение, тъй като NAFLD е метаболитно разстройство и мултисистемно заболяване, силно свързано със затлъстяване, инсулинова резистентност и диабет тип 2 [29], честотата на NAFLD нараства с тревожна скорост [30]. Поради своите ефекти върху чернодробния окислителен капацитет, циркулиращия TG и нивата на свободни мастни киселини, LPIN-1 се предлага като потенциална терапевтична цел за свързана със затлъстяването дислипидемия и NAFLD [30]. Вероятно лечението с тилакоиди увеличава експресията на LPIN-1 в черния дроб, подобно на адипоцитите, което може да намали натрупването на мазнини.

Заключения

В заключение демонстрирахме, че тилакоидите, когато се дават на мишки, хранени с диета с високо съдържание на мазнини, намаляват приема на храна, като същевременно увеличават отделянето на фекални мазнини, без да причиняват стеаторея. Това доведе до намалено телесно тегло, мастна маса и натрупване на мазнини в черния дроб. Установено е, че адипоцитите са с намален размер и вероятно те съответстват на клетъчна популация, която е по-чувствителна към инсулин от по-големите адипоцити. Необходими са допълнителни проучвания, за да се установи дали има промяна в размера на мастните клетки и повишена чувствителност към инсулин и при хората.

Благодарности

Бихме искали да благодарим на Сам Кушман и Мария Линдал за техническата подкрепа.

Финансиране

Тази работа беше финансово подкрепена от Шведската фондация за научни изследвания, Шведската фондация за диабет, Фондация Руно Свенсон, Фондация Ленандър и Фондация Краафорд.

Наличност на данни и материали

Моля, свържете се с автора за искания за данни.

Принос на авторите

KS, ES, CM, EE и CEA допринесоха за дизайна на изследването, изследваха данни, интерпретиране на данни, дискусии и написаха ръкописа. Всички автори прочетоха и одобриха окончателния ръкопис.

Конкуриращи се интереси

Авторите заявяват, че нямат конкуриращи се интереси.

Съгласие за публикуване

Етично одобрение

Местният етичен комитет за експериментални изследвания върху животни в Лунд одобри всички процедури (# M108-13). Съгласие за участие, неприложимо.