Резюме

Ролята на хомоцистеина или неговия предшественик метионин при образуването на фиброзни капачки и връзката му със стреса на ендоплазмения ретикулум (ER) е неясна. Хомоцистеинът може да стимулира натрупването на колаген и да регулира ER стреса шаперон регулиран глюкоза протеин 78 (GRP78). Целта на това проучване е да се определи дали високо диетичният метионин ще увеличи фиброзните капачки и че премахването на атерогенна диета ще намали количеството на ER стресираните клетки. Новозеландските бели зайци са хранени в продължение на 2, 4 или 12 седмици с атерогенна диета [1% метионин + 0,5% холестерол (2MC, 4MC или 12MC)]; за 4 или 12 седмици 0,5% диета с холестерол (4Ch, 12Ch); и за изследване на регресията на плаките, MC диета за 2 или 4 седмици, придружена от 10 седмици нормална диета (2MCr, 4MCr). Изследвани са ендотелна функция, атеросклероза и GRP78 положителни клетки. Ендотелната функция беше премахната в 4MC и атеросклерозата се увеличи 17 пъти (P 2 = 0.9). Тези проучвания предполагат, че високо диетичният метионин може да бъде от полза за стабилизиране на плаката, а нормалната диета също стабилизира плаката и намалява броя на стресираните клетки на плаката.

Ролята на диетичния метионин в развитието на атеросклероза е неясна. Troen et al. са показали, че излишъкът от диетичен метионин може да ускори атеросклерозата при ApoE нокаутиращи мишки Troen et al. 2003 и преди това сме показали подобни ефекти в модела на атеросклероза на заек след 12-седмична диета, съдържаща излишен холестерол и метионин Zulli et al. 2003, 2004. В клиничните условия обаче ефектите на високия плазмен хомоцистеин върху ССЗ остават обезсилени Kaul et al. 2006. Клиничното проучване на HOPE2 показа, че незначителното понижаване на хомоцистеина няма благоприятен ефект върху клиничните резултати, докато проучването FIELD показва, че повишеният хомоцистеин е свързан с 23% намаление на коронарните събития, но без промяна в смъртността. Това повдига въпроса за ефекта на хомоцистеина върху морфологията на плаката, тъй като хомоцистеинът може да индуцира оксидативен стрес, стимулира синтеза на колаген и пролиферацията на гладкомускулни клетки Lentz 2005, фактори, които участват в ремоделирането на плаките.

Това проучване е предназначено (а) за сравняване на клетъчната структура на плаката между висок диетичен холестерол сам и висок диетичен холестерол плюс метионин на 4 и 12 седмици (b), за да се установи точен модел за изследване на атеросклеротичната стабилизация на плаката в рамките на кратък период от време без хирургично намеса (c) за количествено определяне на GRP78 положителни клетки през тези периоди от време.

Методи

Изометрични изследвания на напрежението

Коремните аорти бяха дисектирани на 6 × 3 mm пръстени и последователно монтирани между две метални куки в органни бани, прикрепени към преобразуватели на силово изместване (Grass FT03), свързани към система за събиране на данни (MacLab, ADInstruments, Bellavista, NSW, Австралия). Баните ще се пълнят с разтвор на Krebs и се поддържат при постоянна температура от 37 ° C и непрекъснато се барботират с 95% O2/5% CO2. След 1 h съдовете леко се разтягат до напрежение в покой от 2 g. След още един час се определя максимално свиване чрез разтвор с висок калиев кребс (124 mmol/l K +). След плато (6 минути), съдовете се изплакват с крепчета и 1 час по-късно съдовите пръстени са предварително контрактирани с фенилефрин до приблизително 30-40% от максималното свиване. След като свиването стана стабилно, беше извършена крива на реакция на концентрация на ацетилхолин (10 -8 -10 -6 mol/l Ach, половин log единици) Zulli et al. 2003 г.

Патология на стената

Анализ на данни

Всички точки от данни, анализирани от anova, последвани от Newman – Keuls множествено сравнение post hoc тест или от Student’s-test, бяха подходящи. A P Фигура 1m). Общите нива на холестерола обаче остават повишени поне 5 седмици след започване на диетата. Екстраполативни криви са добавени към фигура 1м. Триглицеридите в кръвта не се различават значително между групите.

холестерол

Регресионна група

След нормалния 10-седмичен режим на хранене се наблюдават дебели фиброзни капачки в коремните аортни плаки както в 2Wr (Фигура 2d), така и в 4Wr (Фигури 1j и 2f, h, i, k, l) и лявата основна коронарна артерия (Фигура 1k ). Всъщност влакнестите капачки съставляват 46% (P Фигура 2m), а съдържанието на макрофаги в плаката намалява с 60% (P Фигура 1l). Това е свързано с подчертано спадане на GRP78 положителни клетки над атеросклеротичните плаки в сравнение с всички други групи (Фигури 2в, д, g, b в сравнение с d, f и количествено изразено в m). Важно е да се отбележи, че количеството плаки в групата 4MC и групата 4MCr не се различава значително (Фигура 1n); обаче имаше значителни промени в биологичната структура на плаката, показващи по-стабилен фенотип на плаката (Фигури 1l и and2m 2m).

За да се покаже колагеновата и клетъчната природа на капачката, беше извършено трихромно оцветяване, както и VSMC (съдова гладкомускулна клетка) имунореакция. Колагенът (син) може ясно да се наблюдава върху клетъчната сърцевина (червен) и е показан на фигура 1i, а VSMC са били забележими в цялата плака (фигура 2j) в сравнение с макрофагите (фигура 1j, 2k). Серийните секции (Фигура 2j, l) ясно показват RAM11 положителни клетки, които реагират с антитялото GRP78. В допълнение, за да се потвърди намаляването на ER стреса, вторият маркер CHOP също е минимално присъстващ в 4Wr.

GRP78 клетки във влакнестата капачка

След това се опитахме да определим количеството положителни GRP78 клетки във фиброзната капачка. Установихме, че в четирите групи с очевидно образуване на фиброзна капачка в атеросклеротичните плаки, има обратна връзка между размера на фиброзната капачка и GRP78 положителни клетки (r 2 = 0,9, фигура 2n).

Ендотелна функция

Дискусия

Основните констатации от това изследване са (а) заешки атеросклеротични плаки в коремната аорта и лявата основна коронарна артерия могат да се стабилизират (дебели влакнести капачки, ниско съдържание на макрофаги) за 10 седмици след 4-седмична атерогенна диета (б) комбинацията от високо диетично хранене метионин плюс холестерол влошава образуването на атеросклероза в рамките на 4 седмици в сравнение с високия диетичен холестерол, но добавянето на висок диетичен метионин към диета с висок холестерол в продължение на 12 седмици причинява по-дебели влакнести капачки в сравнение с холестерол самостоятелно аорта на зайци, хранени с висок хранителен холестерол плюс метионин на 4 седмици, който не се нормализира след 10 седмици нормална диета (d) GRP78 положителни клетки в плаките намаляват по време на регресия.

Моделът на заек е широко използван за изследване на атеросклеротична стабилизация на плаката. Например, настоящите проучвания включват използването на фототочкова фотодинамична терапия, за която е доказано, че насърчава стабилизирането на атеросклеротични плаки на заек и инхибира прогресията на плаката Waksman et al. 2008; интервенция с фенофибрат за подобряване на стабилността на плаките Jeanpierre et al. 2008, както и генетичния хиперлипидемичен модел (WHHL (Watanabe heritable hyperlipidemic) заек) за изследване на ефекта на статините върху индекса на уязвимост на плаката (стабилен фенотип на плаката) Shiomi et al. 2001. В тези модели и модела, представен тук, трябва да подчертаем, че тези плаки не приличат на атеросклероза на коронарна артерия от тип IV на човека Stary 2000; Stary et al. 1995, 1994. Предлагаме обаче, че този модел на заек може да се използва за изследване на фактори, които могат да повлияят на клетъчната биология на плаката, която прилича на по-стабилен фенотип на плаката (индекс на уязвимост на плаката) без необходимост от хирургическа интервенция.

В това проучване наблюдавахме, че плазменият холестерол остава повишен в продължение на повече от 4 седмици след първоначалния двуседмичен или 4-седмичен режим на диета. Това ясно показва нарушения холестеролен клирънс в заешкия модел и се подкрепя от други проучвания, които показват, че плазменият холестерол не се нормализира за кратък период от време Balkan et al. 2004; Fennessy et al. 1994. Тези резултати са в пълен контраст с други, които показват 4-седмична нормална диета след 4-седмична диета с висок холестерол, напълно възстановени нива на холестерол в плазмата Van Winkle & Levy 1970; Ohara et al. 1995. Въпреки че това може да се обясни с разликите в съдържанието на мазнини в диетите, диетата с високо съдържание на мазнини, висок холестерол и висок метионин може да бъде по-физиологично подходяща диета, която да храни само висок холестерол.

В заключение показваме, че само за 4 седмици диетични манипулации зайците проявяват отменена ендотелна функция и тежка атеросклероза и че 10 седмици нормална диета след първоначална 4-седмична атерогенна диета възстановява нормален липиден профил, инициира възстановяване на ендотелната функция и води до по-стабилен фенотип на атеросклеротична плака (дебела фиброзна капачка/ниско съдържание на макрофаги) и намаляване на ER стресираните клетки. Ние също така показваме, че комбинацията от висок хранителен метионин плюс холестерол в продължение на 12 седмици причинява по-стабилен фенотип на плаката, което предполага, че метионинът може да бъде важен стабилизатор на плаката. Нашите резултати хвърлят светлина върху ефектите на метионин върху атерогенезата и възможността за използване на ER инхибитори на стреса в заешкия модел на атеросклероза.