В.М. и O.P. допринесоха еднакво за тази статия.

възпаление

Резюме

Въведение

Епидемията от затлъстяване е нарастващ здравен, социален и икономически проблем в световен мащаб (1). Централното затлъстяване и метаболитният синдром са независими рискови фактори за диабет тип 2, рак, неалкохолна мастна чернодробна болест (NAFLD) и инсулинорезистентно състояние (1,2). През последното десетилетие обединяващият механизъм зад патогенезата на свързаните със затлъстяването заболявания роди концепцията за „мета-възпаление“, която описва хроничния възпалителен отговор с ниско ниво на затлъстяване (3). Ограничената разширяемост на мастната тъкан е друг определящ фактор в патогенезата на свързаните със затлъстяването заболявания (4). Освен това, многобройни доказателства, получени най-вече от проучвания върху мишки, свързват сигналния път без крило (WNT) с регулирането на адипогенезата (5,6) и възпалението (7) при затлъстяване.

Понастоящем няма налични данни относно ефектите на WISP1 върху прицелните инсулинови тъкани, включително черния дроб и мазнините. В настоящото проучване комбинирахме in vitro експерименти с четири независими клинични проучвания, за да потвърдим WISP1 като нов адипокин и да характеризираме връзката на WISP1 с параметрите на метаболитния синдром. Ние показваме, че 1) WISP1 е нов адипокин, освободен от диференцирани човешки адипоцити; 2) Експресията на WISP1 е значително повишена във висцералната мастна тъкан (ДДС), а не в подкожната мастна тъкан (SAT) при глюкозо-толерантни субекти; 3) WISP1 експресията корелира с инсулиновата чувствителност, адипонектин и маркери за възпаление на мастната тъкан; 4) намаляването на теглото намалява експресията на WISP1 в SAT, както и нивата на циркулиращ WISP1 в плазмата; и 5) експресията на WISP1 в черния дроб не показва връзка с ектопичното натрупване на мазнини при затлъстяване.

Изследователски дизайн и методи

Кохорта I

Сдвоени проби от ДДС и SAT са получени от 75 кавказки мъже (n = 40) и жени (n = 35), които са претърпели коремна операция и са метаболитно характеризирани, както е описано по-горе (19). Процентът телесни мазнини е измерен чрез DEXA. В подгрупа (n = 52) съдържанието на коремна висцерална мазнина се измерва чрез ядрено-магнитен резонанс (ЯМР), както е описано по-рано (20). Инсулиновата чувствителност се оценява с метода на евгликемично-хиперинсулинемична скоба, както е описано по-горе (21). Съдържанието на макрофаги в проби от ДДС и SAT се визуализира в участъци на мастната тъкан (оцветени с хематоксилин-еозин) чрез допълнително оцветяване срещу CD68 (1: 200; DAKO), както е описано по-горе (19). Сто клетки бяха изследвани от всеки предмет и бяха преброени CD68 + клетки. Размерът на адипоцитните клетки в ДДС и SAT се анализира в участъци на мастната тъкан, както е описано по-горе (19).

Кохорта II

Ефектите от намаляването на теглото са изследвани при 49 субекта, държани на 8-седмична нискокалорична диета (Modifast; Nutrition et Santé, Revel, Франция), състояща се от 800 kcal/ден плюс 200 g/ден зеленчуци. Участниците, постигнали загуба на тегло от поне 8% след 8 седмици, бяха избрани за проучването. Подробно описание на дизайна на изследването е публикувано преди това (22). Процентът на телесните мазнини е измерен чрез DEXA. Проби от плазма и проби от SAT биопсия бяха събрани след гладуване през нощта преди и след загуба на тегло.

Кохорта III

В кохорти I и III, сдвоени проби от ДДС и SAT бяха получени от същите места по време на коремна операция чрез екстракция с нож. В кохорти II и IV пробите за биопсия на SAT са взети чрез иглена аспирация от контралатерални места на нивото на пъпа. Всички проби незабавно се замразяват бързо в течен азот и се съхраняват при -80 ° C за екстракция на иРНК.

Изследване I беше одобрено от комисията по етика на университета в Лайпциг, Германия, а проучвания II – IV бяха одобрени от комисиите по етика на 1) Университета в Потсдам, Потсдам, Германия; 2) Държавна медицинска асоциация на Бранденбург, Германия; и 3) Charité University Medicine, Берлин, Германия. Всички участници са дали писмено информирано съгласие преди да участват в проучването.

Биохимични измервания

Биохимичните измервания се извършват по рутинни методи. WISP1 в плазмени и средни проби бяха открити чрез търговски анализ (WISP1 ELISA; RayBiotech, Inc., Norcross, GA). За това средните проби бяха концентрирани, използвайки концентратори Vivaspin 2 (Sartorius, Goettingen, Германия). Количественото освобождаване на цитокини в средата за клетъчна култура се използва с помощта на ProcartaPlex Multiplex Immunoassays (eBioscience, Франкфурт на Майн, Германия).

Проучване върху животни

Протоколите за животни бяха одобрени от местния държавен съвет за преглед на етиката на животните (провинция Бранденбург, Германия). Дванадесетседмични мъжки мишки C57BL/6J са държани или на контролна диета (10 kcal-% мазнини, 20 kcal-% протеин, 70 kcal-% въглехидрати, 3.85 kcal/g) или на диета с високо съдържание на мазнини (HFD) (60 kcal-% мазнини, 20 kcal-% протеин, 20 kcal-% въглехидрати, 5,24 kcal/g) (Research Diets, Inc., New Brunswick, NJ) за 6 седмици. Експресията на иРНК на WISP1 беше измерена в епидидимална бяла мастна тъкан, черен дроб и гастрокнемиален мускул.

Клетъчна култура

Макрофагите, получени от човешки моноцити, се диференцират от изолирани кръвни моноцити в среда RPMI 1640, допълнена с 10% HyClone FCS (Thermo Scientific, Waltham, MA) и 50 ng/mL човешки гранулоцитен макрофаг-стимулиращ фактор за колонии (Peprotech, Хамбург, Германия) за 7 дни и се стимулира с рекомбинантен човешки WISP1 (Escherichia coli ендотоксин d -биотин, 15 mmol/L d-пантотенат, 100 nmol/L хидрокортизон, 20 nmol/L инсулин, 0,01 mg/ml трансферин (всички от Sigma-Aldrich, Seelze, Германия ) и 2 μmol/L розиглитазон (Cayman Chemical, Ann Arbor, MI) в продължение на 14 дни. Мордологията на адипоцитите беше потвърдена чрез оцветяване с Oil Red O (допълнителна фигура 1А). Диференцираните адипоцити бяха третирани със 100 nmol/L инсулин (Sigma- Aldrich) за 4 часа или с 0,5 μg/mL WISP1 (Peprotech) за 24 часа.

3T3-L1 адипоцитите бяха диференцирани в DMEM, допълнена с 10% HyClone FCS, 1 μg/L инсулин, 0.5 mmol/L 3-изобутил-1-метилксантин и 0.25 μmol/L дексаметазон в продължение на 7 дни и третирани със или без LY294002 (25 μmol/L, Sigma-Aldrich), PD098059 (30 μmol/L, Sigma-Aldrich) и NVP-AEW541 (0,1 μmol/L, Cayman Chemicals) 30 минути преди стимулация със 100 nmol/L инсулин за 4 часа.

Маслено червено O оцветяване

Диференцираните адипоцити се промиват в PBS и се фиксират с 10% формалдехид в продължение на 60 минути при стайна температура. След това всяка ямка се изплаква внимателно с вода и към всяка ямка се добавя 60% изопропанол за 5 минути. Работният разтвор Oil Red O се приготвя чрез смесване на три части основен разтвор Oil Red O (Sigma-Aldrich) с две части дейонизирана вода. Културите бяха инкубирани с работен разтвор Oil Red O за 5 минути при стайна температура. Разтворът на Oil Red O се отстранява и културите се измиват с чешмяна вода, докато изплакванията се изчистят.

Количествена PCR в реално време

Общата РНК се екстрахира от NucleoSpin RNA II Kit (Macherey-Nagel, Düren, Германия) или RNeasy Lipid Tissue Mini Kit (QIAGEN, Hilden, Германия). Синтезата на cDNA беше извършена с помощта на комплект за обратна транскрипция на cDNA с голям капацитет (Applied Biosystems, Foster City, CA). Количествената PCR в реално време (qRT-PCR) беше извършена с помощта на Power SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems) и праймери, показани в допълнителна таблица 1.

Западно петно

Semidry имуноблоти бяха извършени с антитела, специфични за фосфо-p44/42 митоген-активирана протеин киназа (MAPK) (фосфорилирана извънклетъчна свързана със сигнала киназа [ERK]), p44/42 MAPK (ERK), фосфо-Akt и Akt (Life Technologies/Cell Signaling, Бостън, Масачузетс, WISP1 (ab10737, Abcam, Cambridge, MA), α-тубулин (Life Technologies/Cell Signaling) и IRDye 800CW Goat anti-Rabbit IgM (LI-COR Biosciences, Lincoln, NE) и количествено определени от системата за инфрачервени изображения на Odyssey (LI-COR Biosciences, Бад Хомбург, Германия).

Статистически анализ

За всички статистически анализи е използван софтуер SPSS версия 20.0 (IBM Corporation, Чикаго, Илинойс). Ако не е посочено друго, данните са средни ± SEM. Наличието или отсъствието на нормално разпределение се проверява чрез теста на Колмогоров-Смирнов. В зависимост от разпределението на данните за корелационен анализ се използва прост коефициент на Пиърсън или коефициент на корелация на ранг на Спирман, а за оценка на разликите между групите се прилага U-тест на Mann-Whitney или Student t тест. P Вижте тази таблица:

  • Преглед на линия
  • Преглед на изскачащия прозорец

Клинични характеристики на изследваните кохорти