От д-р Каролина Шчесна, старши продуктов мениджър и техническа поддръжка, Proteintech

тегло

Уестърн блотинг и изчисления на молекулното тегло

Уестърн блотинг (или имуноблотинг) е често използвана техника за молекулярна биология за анализ на протеини. Прогнозираното молекулно тегло на протеина (MW) е сумата от всички MW на протеиновите аминокиселини. Може да се изчисли, като се използва например онлайн инструментът ExPASy. Въпреки това, изчислената MW може да се различава от тази, наблюдавана при Western blot. Фигурата по-долу обобщава най-често срещаните причини защо това може да се случи (Фигура 1).

Фигура 1. Най-честите причини за разликите между наблюдаваните и теоретичните MW. Кредит: Proteintech.
1. Сигналният пептид (и пропептид) се разцепва

Много протеини, които се транспортират по секреторния път, имат сигнални пептиди с дължина 15–35 аминокиселини, разположени предимно в техните N-краища. Те често се разцепват от различни протеази по време на субклетъчен транспорт, в резултат на което зрелият протеин работи с по-ниска от предвидената MW. Наличието на сигнален пептид може да се предскаже с помощта на различни онлайн инструменти или може да се установи въз основа на предварително публикувани данни. Те обикновено се коментират добре в протеинови бази данни, например UniProt. Освен това подгрупа протеини има пропептиди - протеинови домейни, които присъстват в протеиновите предшественици. Протеиновите предшественици трябва да бъдат обработени от протеази, за да се породи функционален продукт, без пропептид (Фигура 2).

2. Пост-транслационни модификации (PTM)

PTMs са ковалентни модификации на протеини, които се появяват след техния синтез. Много модификации се катализират от ензими, които се намират в секреторния път, т.е. ендоплазмен ретикулум и апарат на Голджи. PTMs са важни регулатори на протеин-протеиновите взаимодействия, протеинова стабилност, функция, ензимна активност и локализация. Най-честата модификация е фосфорилирането, което се случва предимно върху остатъци от серин, тирозин и треонин. Фосфорилирането, подобно на много други РТМ, често е преходно - киназите катализират свързването на фосфорилните групи, докато фосфатазите ги отстраняват. Повечето протеини се подлагат на N-крайно ацетилиране, ензимна реакция, катализирана от N-крайни ацетилтрансферази (NAT). Някои аминокиселинни остатъци могат да бъдат свързани с олигозахариди в процес, известен като N- и O-свързано гликозилиране. Убиквитинацията, добавянето на убиквитин, е често срещана начална стъпка за разграждане на протеазомите. Можете да научите повече за PTM тук.

Гликозилиране и гликанизиране

Повечето протеини, които се синтезират върху рибозомите, свързани с ендоплазмения ретикулум, се подлагат на гликозилиране. Това означава, че към полипептидната верига се добавя ковалентно свързване на захарни части.

Фосфорилиране


Един от най-често срещаните PTMs е фосфорилирането на протеини, което се извършва върху остатъци от серин, треонин и тирозин. Фосфорилирането регулира белтъчната функция, неговата ензимна активност, протеиново-протеиновите взаимодействия и локализацията на протеините.

Добавянето на единична фосфорилова група добавя +/- 1 kDa към MW, което често е извън разделителната способност на стандартния SDS-PAGE. Многобройните места на фосфорилиране обаче могат да доведат до по-видни промени в MW.

Убиквитация


Протеин убиквитиниране означава, че ковалентен убиквитин се добавя към лизин, цистеин, серин, треонин или директно към N-края на протеина. Убиквитинацията чрез протеома може да маркира протеини за разграждане.

3. Протеинови комплекси

По-голямата част от протеиновите комплекси се състоят от протеини, свързани с нековалентни връзки. Тези взаимодействия се разрушават по време на подготовката на пробата и електрофорезата и отделните протеини се изпълняват като мономери. Това се дължи на факта, че SDS-PAGE за Western blotting се извършва в редуциращи условия. Въпреки това, някои протеинови комплекси не са напълно нарушени и протеините все още могат да съществуват под формата на хомо- или хетеромерни комплекси, дори в присъствието на редуциращи агенти, като SDS и β-меркаптоетанол. Наблюдаваната MW на комплексите впоследствие е по-висока от изчислената MW на мономерите. Също така е обичайно да се наблюдават множество ленти, които представляват мономерни и сложни видове (Фигура 3).

Забележка: 20% β-меркаптоетанол (или 100 mM DTT) за 4X SDS буфер за проби може да помогне за премахването на неспецифични ленти поради дисоциация на протеиновия комплекс.

Фигура 3: NQO1 (11451-1-AP) е ензим, който служи като хинон редуктаза заедно с реакции на конюгиране на хидрохиноните, участващи в пътищата на детоксикация, както и в биосинтетични процеси като зависима от витамин К гама-карбоксилиране на остатъци от глутамат в синтеза на протромбин. NQO1 има три изоформи: 26, 27 и 31 kDa MW, а за ензимната му активност е необходимо образуването на хомодимери (66-70 kDa).

Mlx-взаимодействащият протеин (MLXIP, известен също като MONDOA) (13614-1-AP) действа като транскрипционен фактор, образувайки хетеродимер с MLX протеин. Този комплекс свързва и активира транскрипцията от CACGTG E кутии, като играе роля в транскрипционното активиране на гликолитичната цел и глюкозно-реагиращата генна регулация. MLXIP има три изоформи: 110, 57 и 69 kDa, а MW на хетеродимера MLXIP-MLX е 130 kDa. Кредит: Proteintech.

4. Протеинови изоформи

При еукариотите, наскоро транскрибираните пре-иРНК преминават през диференциални етапи на зреене на иРНК, което води до видове иРНК, които се различават по броя и дължината на екзоните - кодиращи протеина последователности. Протеиновите варианти на същия ген се разглеждат като протеинови изоформи. Протеиновите изоформи могат да се различават в моделите на експресия на тъканите и могат да имат отличителни физиологични роли. Поради разнообразното си съдържание на екзон, протеиновите изоформи могат да се различават в MW (Фигура 4). Освен това, иРНК могат да носят повече от едно начално място на транслация (TSS), отбелязващо началото на N-края на протеините. Използването на множество TSS създава протеинови изоформи с различен N-край и следователно различни MW.

Изборът на буфер за екстракция е от съществено значение за намаляване на ефекта на кръстосаната реактивност на антителата. Ако анализираният протеин е цитоплазматичен, мек екстракционен буфер, който не извлича ядрени протеини (напр. Използване на сапонин като детергент), може да бъде по-подходящ за намаляване на неспецифичната кръстосана реактивност с ядрени протеини. След прехвърлянето на протеина от полиакриламиден гел върху мембрана, типът блокиращ буфер, времето на инкубация на мембраните с първични и вторични антитела и етапът на промиване изискват оптимизация. Препоръчва се да се сравняват различни типове антитела, повдигнати срещу целевия протеин. Ако се открие кръстосана реактивност с поликлонални антитела, тя може да не се наблюдава при моноклонални антитела, които са повдигнати срещу специфичен епитоп, а не цялата протеинова последователност или по-голям протеинов фрагмент.

б. Неспецифично протеолитично разцепване и разграждане на протеини

Протеините могат да бъдат обект на неспецифично протеолитично разцепване и разграждане. Разграждането на клетките и тъканите освобождава извънклетъчни и вътреклетъчни протеази, които могат да разцепват протеините в полипептиди. Следователно е жизненоважно да се допълнят лизисните буфери с протеазни инхибитори, които блокират активността на протеазите. Предложението е да се извърши клетъчен лизис върху лед, за да се предотврати допълнително разграждането на протеина. Както протеолитичното разцепване, така и разграждането могат да повлияят на протеините в различна степен и да доведат до протеинови фрагменти с по-ниска MW.

Наблюдавано MW

1. PTM (виж точка 2).

2. Антитялото открива протеинова изоформа с по-дълга последователност (виж точка 4).

3. Протеинови комплекси (вж. Точка 3).

1. Разцепване на сигнален пептид (виж точка 1).

2. Антитялото открива протеинова изоформа с по-кратка последователност (виж точка 4).

3. Неспецифично разцепване на протеини (вж. Точка 5б).

1. Протеинови изоформи (виж точка 4).

2. Един протеинов продукт, но с различни посттранслационни модификации (вж. Точка 2).

3. Антитялото открива протеин със и без пропептид (вж. Точка 1).

4. Протеинови комплекси (вж. Точка 3).

5. Кръстосана реактивност на антитела (вж. Точка 5а), потенциално поради хомология на имуногенната последователност.

1. Разцепване на протеини (вж. Точка 5б).

2. Разграждане на протеини (вж. Точка 5б).

- Уверете се, че сте включили подходящи контроли (вж. Точка 5а).

- Възможно е да е необходима допълнителна оптимизация на протокола (вж. Точка 5а).