Катлийн М. Херцер

1 Катедра по хирургия, Лабораторна медицина, Медицински факултет на Дейвид Гефен в UCLA

Mu Xu

1 Катедра по хирургия, Лабораторна медицина, Медицински факултет на Дейвид Гефен в UCLA

Оуне Моро

1 Катедра по хирургия, Лабораторна медицина, Медицински факултет на Дейвид Гефен в UCLA

Дейвид У. Доусън

2 Катедра по патология и лабораторна медицина, Медицински факултет на Дейвид Гефен в UCLA

Лин Ду

3 Катедра по биостатистика, Fielding School of Public Health в UCLA, Лос Анджелис, Калифорния

Банда Ли

3 Катедра по биостатистика, Училище за обществено здраве в UCLA, Лос Анджелис, Калифорния

Хуей-Хуа Чанг

1 Катедра по хирургия, Лабораторна медицина, Медицински факултет на Дейвид Гефен в UCLA

Александър П. Старк

1 Катедра по хирургия, Лабораторна медицина, Медицински факултет на Дейвид Гефен в UCLA

Ксиаоман Юнг

1 Катедра по хирургия, Лабораторна медицина, Медицински факултет на Дейвид Гефен в UCLA

О. Джо Хайнс

1 Катедра по хирургия, лабораторна медицина, Медицински факултет на Дейвид Гефен в UCLA

Гуидо Ейбл

1 Катедра по хирургия, Лабораторна медицина, Медицински факултет на Дейвид Гефен в UCLA

Резюме

Цели

Затлъстяването увеличава честотата на множество видове рак. Предишната ни работа показа, че високомаслената, висококалорична диета (HFCD) води до висцерално затлъстяване, възпаление на панкреаса и ускорена панкреатична неоплазия при мишките KrasG12D (KC). В това проучване имахме за цел да изследваме ефектите на HFCD върху висцералното мастно възпаление с акцент върху потенциалните разлики между отделните висцерални мастни депа.

Методи

Изследвахме теглото и висцералното затлъстяване както при див тип (WT), така и при KC мишки или на контролна диета (CD), или на HFCD. След три месеца мишки бяха умъртвени за хистологично изследване. Бяха проведени и мултиплексни анализи за получаване на цитокинови профили между различни мастни депа.

Резултати

Както WT, така и KC мишките на HFCD проявяват значително повишено възпаление във висцералната мастна тъкан (ДДС), особено в пери панкреатичната мазнина (PPF), в сравнение с животните на CD. Това е свързано със значително повишено възпаление в панкреаса. Цитокиновите профили са различни между висцералните мастни депа и между мишките на HFCD и CD.

Заключения

Нашите резултати ясно показват, че HFCD води до затлъстяване и възпаление в ДДС, особено PPF. Тези данни предполагат, че свързаното със затлъстяването възпаление при PPF може да ускори панкреатичната неоплазия при KC мишка.

Въведение

Ракът на панкреаса (PaCa) продължава да бъде едно от най-трудните за лечение заболявания и сега се прогнозира, че до 2030 г. той ще бъде втората най-често срещана причина за смъртни случаи, свързани с рак след рак на белия дроб 1. Въпреки че много активните изследвания продължават новите лечебни методи и начини за ранно откриване, подобренията в превенцията и модификацията на риска са еднакво или може би по-важни за промяна на хода на тази смъртоносна болест. Един такъв рисков фактор, затлъстяването, е обект на много научни изследвания, тъй като той отдавна е признат като участник в няколко основни хронични здравни проблема, включително диабет, сърдечни заболявания, в допълнение към множество видове рак 2 .

Освен общото затлъстяване, излишъкът от висцерална мастна тъкан (ДДС) е специално свързан с повишен риск от метаболитни нарушения и различни видове рак, включително рак на хранопровода, дебелото черво, черния дроб и панкреаса 3–7. Няколко епидемиологични проучвания установиха, че положителната връзка между прекомерния ДДС (измерен чрез обиколката на талията или чрез CT/MRI изображения) и рака на хранопровода и дебелото черво е независима от ИТМ 6. Прекомерното ДДС също увеличава честотата на лезии на предшественици на рак. Например, той е в положителна корелация с гастроезофагеална рефлуксна болест (ГЕРБ) и хранопровода на Барет, както и аденокарцином на хранопровода 8,9. Прекомерното ДДС също увеличава честотата на безалкохолен стеатохепатит (NASH), нарастваща причина за хепатоцелуларен карцином 10,11 .

В предишните си проучвания демонстрирахме, че диетата с високо съдържание на мазнини и калории води до значително увеличаване на теглото, метаболитни нарушения, възпаление в панкреаса и ускоряване на панкреатичната неоплазия в условния модел на мишка на рак на панкреаса KrasG12D 20. В настоящата работа ние предоставяме доказателства, че в този модел на мишка затлъстяването допринася за силно възпаление на ДДС, по-специално в пери панкреатичната мастна тъкан, която от своя страна може да бъде отговорна за ускоряване на възпалението и неопластичната прогресия в съседния панкреас.

Материали и методи

Модел на мишка

Условният модел на KrasG12D (KC) за рак на панкреаса от Hingorani et al. беше използвано за това проучване 21. Потомци от кръстоски на мишки LSL-KrasG12D и PDX-1-Cre (или p48-Cre) бяха разпределени произволно или на контролна диета (CD), или на висококалорична диета с високо съдържание на мазнини (HFCD) в продължение на 10 седмици. Индивидуално маркираните мишки имат свободен достъп до диетата, както и до вода. Приемът на храна и телесното тегло на всяко животно се измерват два пъти седмично. Проучванията върху животни са одобрени от Комитета за изследване на животните на Канцлера на Калифорнийския университет, Лос Анджелис, в съответствие с Ръководството на NIH за грижа и използване на лабораторни животни.

Анализ на генотипирането

Преди рандомизирането на изследваните диети, присъствието на алела Kras G12D и Cre се определя чрез PCR анализ на геномна ДНК, както е описано другаде 22. Животните както с алелите Kras G12D, така и с Cre бяха определени като мутантни (KRAS +/G12D), а животните с нито Kras G12D, нито с алела Cre бяха считани за див тип (KRAS +/+). В края на изследването при жертвоприношението успешните събития на ексцизия-рекомбинация бяха потвърдени чрез PCR чрез наличието на единично място LoxP в панкреаса, както е описано другаде 22 .

Експериментални диети

Диетите са получени от Dyets, Inc., Пенсилвания. Отбитите мишки се разпределят или на CD, или на HFCD, както е описано по-рано 20. Накратко, 40% и 12% от калориите са получени от мазнини (на основата на царевично масло), съответно в HFCD и CD. Диетите се обработват при условия на слаба светлина и се съхраняват при -20 ° C. Диетите бяха заменени два пъти седмично. Стабилността на мастните киселини в диетите се наблюдава редовно от UCLA Nutritional Biomarker and Phytochemistry Core.

приготвяне на пробата

Висцералните органи (включително черния дроб и панкреаса), както и различни депа за мазнини са или замразени веднага след дисекция в течен азот и съхранявани при -80 ° С до по-нататъшна обработка, или фиксирани в разтвор на 10% формалин и впоследствие вграден парафин. Мастната тъкан близо до половите жлези е обозначена като висцерална мастна тъкан (VF), а мастната тъкан в съседство и припокриване на панкреаса е обозначена като пери-панкреатична мазнина (PPF).

Количествено определяне на обема на мастната тъкан

Преди жертвоприношението, всички мишки бяха изобразени чрез микро-CT в UCLA Pre-Clinical Imaging Center. Общият ДДС се определя количествено като част от общия обем на коремните меки тъкани въз основа на единици на Hounsfield в избрана област от горната част на корема. Мастната тъкан се определя като тъкан в диапазона от -270 до -100 единици Hounsfield, докато -270 до 500 единици Hounsfield са използвани за обща мека тъкан.

Хистология на мастната тъкан

Анализи на цитокини

Замразена замразена мастна тъкан на мишка (VF или PPF) се размразява върху лед и се хомогенизира с механичен хомогенизатор в 1xPBS, рН 7,2, 1 mmol/L фенилметилсулфонилфлуорид (Sigma-Aldrich) с протеазни инхибитори (Пълна протеазна инхибиторна коктейлна таблетка, Roche) и впоследствие ултразвук. След това лизатите се центрофугират при 4 ° С в продължение на 15 минути при 14 000 об/мин и супернатантата се отделя от гранулата с помощта на игла и спринцовка с размер 26. Концентрациите на протеини се определят чрез анализ на протеин на бицинхонинова киселина (Thermo Scientific) с говежди серумен албумин като стандарт. Лизатите се разреждат до обща концентрация на протеин от 1 mg/ml и се прилагат върху панел с магнитни топчета на миши цитокин (EMD Millipore) във формат с 96 ямки. Дубликати на всяка проба се инкубират цяла нощ на ротационен орбитален шейкър при 4 ° С. След това плочите се обработват, както се препоръчва от производителя, и пробите се пускат с помощта на Bio-Plex 200 HTF анализатор Luminex система (Bio-Rad). Данните бяха получени със софтуера Bio-Plex Manager 6.1 (Bio-Rad) и допълнително анализирани с Microsoft Excel.

Хистология на панкреаса

Секции на панкреаса на всяко животно бяха оцветени с хематоксилин и еозин (H&E) и анализирани от GI патолог (D. Dawson), заслепен за условията на лечение. Възпалението е степенувано, както е описано по-рано (Dawson 2013). Накратко, загубата на ацинари се основава на процентната загуба в цялото напречно сечение и се оценява като 0 = отсъства; 1 = 1-25%; 2 = 26-50%; 3 = 51–75%; 4> 75%. Възпалението се основава на средния брой лобуларни възпалителни клетки на 40 × поле с висока мощност (HPF; както се брои в 10 неприпокриващи се HPF) и се оценява като 0 = отсъства; 1 = 1–30 клетки; 2 = 31-50 клетки; 3 = 51–100 клетки; 4> 100 клетки. Фиброзата се основава на кумулативната област на стромална фиброза в целия панкреас и се оценява като 0 = липсва; 1 = 1-5%; 2 = 6–10%; 3 = 11–20%; 4 => 20%. Миши PanINs са класифицирани според хистопатологични критерии, както е описано по-рано 20. Определен е общият брой на дукталните лезии и степента им. Оценена е само най-високата степен на лезия на панкреатична лобула. Около 100 панкреатични канала на целия фиксиран образец (глава, тяло и опашка на панкреаса) са анализирани за всяко животно. Относителното съотношение на всеки mPanIN към общия брой анализирани канали е записано за всяко животно.

Статистически анализ

Стойностите са представени като средна стойност ± SEM. Значимостта се определя с помощта на несдвоен t тест, като значимостта се определя при р-стойност на Фигура 1). За да се определи как общото наддаване на тегло е свързано с разширяването на ДДС, всички мишки са били изобразени чрез микро-КТ преди жертване. Използвайки определена област в горната част на корема, общата печалба от ДДС беше измерена като част от общата мека тъкан в същия регион. WT мишките на HFCD са получили приблизително 2 пъти повече общ ДДС, отколкото WT мишките, хранени със CD (p Фигура 1). Увеличението на ДДС корелира силно с увеличаването на теглото (коефициент на корелация на Пиърсън> 0,9; не е показано). KC мишките също показаха увеличение на обема на ДДС, измерен количествено чрез микро-CT. Докато мъжките KC мишки спечелиха

Двукратно повече обем на ДДС в сравнение със своите CD аналози (подобно на WT мишки) женски KC мишки, хранени с HFCD, не са увеличили значително общия си обем на ДДС (Фигура 1). Като цяло женските мишки наддават по-малко тегло от своите колеги, а KC мишките наддават по-малко от WT мишките. Тези резултати обаче показват, че както WT, така и KC мишките наддават на HFCD и като цяло наддаването на тегло корелира силно с увеличаване на общия ДДС.

възпаление

Възпалителните огнища при мъжки и женски WT (A) и KC (B) мишки на CD и HFCD бяха количествено определени. Представителни хистологични изображения са показани в горните редове. *, p Фигура 2А, стрелка). След това преброихме броя на мишките, при които се виждаха големи лимфоидни агрегати или във VF, или в PPF (Фигура 2C). Като цяло, лимфоидните агрегати се срещат по-често в PPF, отколкото в VF (p Фигура 2C). Освен това е установено, че лимфоидните агрегати се срещат по-често при KC мишки в сравнение с WT мишки и при мишки, хранени с HFCD (в сравнение с CD) (Фигура 2C).

В литературата има доказателства, че различните метаболитни фенотипове на различни висцерални мастни депа често съответстват на различни размери на отделните адипоцити 13. За да се оцени дали PPF и VF в нашия модел показват потенциално различни метаболитни фенотипове, ние определихме количествено размера (площта) на отделните адипоцити както в VF, така и в PPF. Както за WT, така и за KC мишки, адипоцитите в PPF са значително по-малки от тези в VF (Фигури 3А, В). В допълнение, HFCD значително увеличава размера на адипоцитите както в VF, така и в PPF. Въпреки това, ефектът на HFCD върху размера на адипоцитите е значително по-силен при VF, отколкото при PPF.

Размерът на адипоцитите във висцералната (VF) и перипанкреатичната мазнина (PPF) депо са измерени както при WT (A), така и при KC (B) мишки. Бяха направени десет изображения на мишка и бяха измерени 10 адипоцити на изображение. Площта е представена като средната стойност ± SEM. *, p Фигури 4А, В). Най-често изходната експресия на тези цитокини се увеличава в PPF в сравнение с VF. В допълнение, HFCD увеличава експресията на някои цитокини, специфично в PPF, но не и в VF (Фигура 4C). Взети заедно, тези данни ясно показват, че функционалните разлики, измерени чрез експресия на цитокини (изходно ниво и в отговор на диетата), съществуват между VF и PPF както при WT, така и при KC мишки.

Нивата на тъканни цитокини в депата VF и PPF бяха измерени в моя мултиплекс. Нивата на тъканите на избрани цитокини във VF се нормализират до 1 и променят промените в PPF, изобразени при WT (A) и KC (B) мишки. Данните са представени като средно ± SEM. Тъканните нива на IFN-y във VF и PPF на мишки, хранени с CD и HFCD, са изобразени в C). *, p Фигура 5А), което е илюстрирано със загуба на нормална ацинарна структура (12 ± 4% CD срещу 37 ± 10% HFCD), увеличаване на възпалителната клетъчна инфилтрация (11 ± 4 CD срещу 26 ± 6 HFCD) и чрез увеличаване на стромалната фиброза (5 ± 2% CD срещу 20 ± 6% HFCD). Имаше тенденция към малко повече PanIN1b и PanIN2 при KC мишки на HFCD (в сравнение с CD), въпреки че тези промени не достигнаха статистическа значимост на 10 седмици (Фигура 5В). При WT мишки не са наблюдавани доказателства за неоплазия, въпреки че са наблюдавани доказателства за възпаление на панкреаса при мишки, хранени с HFCD (данните не са показани). Тези резултати показват, че храненето с HFCD в продължение на 10 седмици създава значително по-силна възпалителна среда в панкреаса (в сравнение с мишки, хранени със CD); обаче на този ранен етап не могат да бъдат открити значителни разлики в неопластичните лезии в панкреаса между CD- и HFCD-хранени KC мишки.

Полуколичествени анализи на възпалителни параметри в панкреаса на мишки, хранени с контролната диета или HFCD. (А) Анализирани са процент (%) от непокътнати ацини, процент (%) от загуба на ацинарни клетки, брой възпалителни клетки на HPF и процент (%) на стромална фиброза. *, стр. 13,26,27 .

Съществуват много малко знания за ролята на PPF при болестта на панкреаса при хората. При тежък остър панкреатит PPF некрозата е свързана с тежестта на заболяването 28. При PaCa инвазията на PPF от раковите клетки е идентифицирана като независим предиктор за лош резултат след панкреатодуоденектомия 29–31. Дефицитът на PEDF (фактор, получен от пигментиран епител) в модела Ela (еластаза) -Kras доведе до инвазивна PaCa, която е свързана с увеличен PPF 32, което предполага връзка между PPF и прогресията на аденокарцинома на панкреаса. Наскоро беше установено, че PEDF има ефект против затлъстяване, като противодейства на инсулиновата резистентност и потиска растежа на тумора на панкреаса при високи концентрации 33. За разлика от това, нулевите мишки с PEDF имат затлъстяване на труна и увеличен PPF 34 .

Нашите резултати показват, че възпалението на ДДС, свързано със затлъстяването, може да бъде интригуваща цел за предотвратяване на развитието на PaCa. Бариатричната хирургия се превърна в стандартно лечение за пациенти със затлъстяване. Може да намали размера на PPF 40. Дългосрочното проследяване след бариатрична хирургия потвърди значителна загуба на тегло, както и намаляване на появата на множество видове рак, по-специално рак на гърдата и ендометриума 41–43. Медицинската терапия също показа обещаващи резултати. Неотдавнашно проучване показа, че тиазолидиндионите (TZD), PPAR (лиганд, активиран от пероксизомен пролифератор), могат да намалят възпалението в мастната тъкан и да намалят размера на PPF 44. Доказано е, че метформинът, който повишава чувствителността към инсулин и причинява загуба на тегло при пациенти със затлъстяване, намалява риска от PaCa при диабет тип II, както и много други видове рак 45,46 .

В заключение, нашите резултати показват, че HFCD води до повишено възпаление на ДДС, особено в пери панкреатичния регион, в модела на мишка KC на PaCa. Повишеното възпаление на ДДС е свързано с повишено възпаление на панкреаса, но се е появило преди развитието на панкреатична неоплазия. Заедно с предишния ни доклад, показващ засилена панкреатична неоплазия при KC мишки, хранени с HFCD за по-дълъг период от време, тези резултати категорично предполагат важна и ранна роля на възпалението на ДДС при развитието на рак на панкреаса.

Благодарности

Национални здравни институти (P01CA163200, DK41301, UL1TR000124, T32 Гаранти за обучение по гастроентерология DK07180-40) и Фондация за изследване на рака на панкреаса Хиршберг