Отдел за биомедицински изследвания на Wakefield, Катедра по патология и молекулярна медицина, Университет в Отаго, Уелингтън, Нова Зеландия

аберантен

Отдел за биомедицински изследвания на Wakefield, Катедра по патология и молекулярна медицина, Университет в Отаго, Уелингтън, Нова Зеландия

Отделение за биомедицински изследвания на Уейкфийлд, Катедра по патология и молекулярна медицина, Университет в Отаго, Уелингтън, Нова Зеландия, клиника Уейкфийлд, болница Уейкфийлд, Уелингтън, Нова Зеландия

Отдел за биомедицински изследвания Wakefield, Катедра по патология и молекулярна медицина, Университет в Отаго, Уелингтън, Нова Зеландия, Училището за медицински изследвания Джон Къртин, Австралийският национален университет, Канбера, Австралия

  • Винко Бешич,
  • Хонгджун Ши,
  • Ричард С. Стъбс,
  • Марк Т. Хейс

Фигури

Резюме

Цитат: Besic V, Shi H, Stubbs RS, Hayes MT (2015) Аберрантен чернодробен инсулинов рецептор Изоформа А експресията се нормализира с ремисия на диабет тип 2 след стомашна байпас хирургия. PLoS ONE 10 (3): e0119270. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0119270

Академичен редактор: Виктор Санчес-Маргалет, Университетска болница Вирген Макарена, Медицински факултет, Университет в Севиля, ИСПАНИЯ

Получено: 9 октомври 2014 г .; Прието: 12 януари 2015 г .; Публикувано: 5 март 2015 г.

Наличност на данни: Всички релевантни данни се намират в хартията и нейните поддържащи информационни файлове.

Финансиране: Тази работа беше подкрепена от Фондация за медицински изследвания в Уелингтън, Wakefield Gastroenterology Research Trust и Wakefield Clinic, които осигуриха вноски за заплати и консумативи. Финансистите не са играли роля в дизайна на проучването, събирането и анализа на данни, решението за публикуване или подготовката на ръкописа.

Конкуриращи се интереси: Авторите са декларирали, че не съществуват конкуриращи се интереси.

Въведение

Захарният диабет тип 2 (T2DM) е резултат от прогресивно увеличаване на инсулиновата резистентност - възпрепятстван биологичен отговор на инсулин - съчетан с прогресивна загуба на бета-клетъчна функция и/или маса. Инсулиновата сигнализация се осъществява чрез инсулиновия рецептор (INSR) [1,2] и откриването на изоформите на INSR през 80-те години доведе до обширни изследвания за тяхната роля в действието на инсулина [3]. Оттогава бяха събрани масивни доказателства за пост-рецепторни събития на инсулиновия сигнальен път, но средствата, чрез които изоформите INSR медиират инсулиновата сигнализация, все още не са ясни.

Алтернативно сплайсинг на екзон 11 произвежда две различни протеинови изоформи: INSRA (без екзон 11) и INSRB (с екзон 11) [3]. Настоящите доказателства за функционалните свойства на двете изоформи предполагат, че инсулиновата сигнализация чрез INSRA е предимно митогенна, докато инсулиновата сигнализация, въпреки че INSRB е метаболитна (за преглед вж. Belfiore et al. [4]). Митогенната сигнализация чрез INSRA се дължи частично на високия му афинитет към лиганди като инсулиноподобен растежен фактор II (IGF-II) и проинсулин, като и двата стимулират растежните отговори [5–8]. От друга страна, in vitro експерименти с третирани с дексаметазон HepG2 клетки показват, че увеличаването на експресията на INSRB подобрява инсулиновата чувствителност за медииран от инсулин метаболизъм на глюкозата и генна експресия [9,10]. Тези данни са в съответствие с тъканното разпределение на двете изоформи. Поради своите митогенни характеристики, INSRA преобладава в тъканите за развитие, като фетални клетки [8] и може да е необходима за усвояване на глюкоза в новородени хепатоцити [11,12]. Обратно, INSRB се експресира в диференцирани възрастни клетки и е преобладаващ в инсулино-чувствителните тъкани, които регулират глюкозната хомеостаза като черния дроб [13,14].

Сигнализирането през INSR изоформите се модулира допълнително чрез образуване на хетеродимери INSRA/INSRB. Образуването на INSR хетеродимери се управлява от произволен модел на сглобяване, зависим от относителното изобилие на двете изоформи, като по този начин промените в нивата на експресия на изоформата ще имат ефект върху клетъчната сигнализация. Въпреки че INSRA/INSRB рецепторите запазват афинитета си към инсулин, те получават увеличение на афинитета към IGF-II, което е сравнимо с INSRA хомодимерите [15]. Отменени съотношения на експресия на INSR са наблюдавани при рак и T2DM. INSRA е свръхекспресиран при различни видове рак [16,17] и е хипотезиран като потенциален механизъм за стимулиращ рака ефект на хиперинсулинемия при затлъстяване и диабет [4,16]. Променената относителна експресия на двете изоформи на INSR може да има роля в T2DM, въпреки че в литературата има противоречиви доказателства [18–24]. Повечето проучвания, анализиращи тези изоформи по отношение на инсулиновата резистентност и T2DM, използват скелетни мускули и мастна тъкан с малко налични данни за относителната експресия на изоформи INSR в черния дроб.

Множество реплики сочат черния дроб като важен орган в онтологията на T2DM. Повишеното регулиране на чернодробната глюконеогенеза е основен фактор за хипергликемията на гладно, наблюдавана при T2DM [25,26]. Някои изследвания, използващи животински модели, предполагат, че инсулиновата резистентност на черния дроб води до инсулинова резистентност на цялото тяло и непоносимост към глюкоза [27–29]. Нито мастните, нито мускулните нокаутиращи рецептори на инсулинови рецептори имат патологични промени в нивата на глюкоза и инсулин [30,31], но мишките с чернодробни инсулинови рецептори развиват както хипергликемия, така и хиперинсулинемия [28,32]. И накрая, подобрената инсулинова резистентност в черния дроб се свързва с ранните ефекти на стомашния байпас на Roux-en-Y (RYGB) върху гликемичния контрол [33]. Няколко проучвания показват, че инсулиновата резистентност на черния дроб бързо се подобрява след операция RYGB, но инсулиновата резистентност на цялото тяло може да продължи до шест месеца след операцията, намалявайки пропорционално на загубата на тегло [33–36].

В това проучване използвахме операцията RYGB, за да изследваме ролята на чернодробните INSR изоформи в патологията на инсулиновата резистентност. Измерихме относителната експресия на INSR изоформа mRNA в чернодробна тъкан от лица с и без T2DM, взети при операция на RYGB и при втора операция. Също така свръхекспресирахме изоформите INSR в клетките на човешки хепатом HepG2, за да изследваме дали фосфорилирането на AKT и инхибирането на транскрипцията на фосфенолпируват карбоксикиназа (PCK1) се различава в отговор на натоварването с инсулин между двете изоформи.

Материали и методи

Ние изследвахме INSR и неговите изоформи, като използвахме чернодробна тъкан, взета от пациенти със затлъстяване, претърпели открита операция на RYGB, както е описано подробно от нашата група другаде [37]. Събирането на проби и последващи анализи бяха специално одобрени от Централния комитет по етика на здравето и уврежданията на Министерството на здравеопазването на Нова Зеландия (одобрение № WGT/00/04/030). Писмено информирано съгласие е дадено от всички лица, които са били включени в проучването и всички клинични изследвания са проведени в съответствие с принципите, изразени в Декларацията от Хелзинки. Всички операции са извършени от един и същ хирург (проф. Стъбс). По време на операция на RYGB беше взета чернодробна биопсия с помощта на игла за биопсия Tru-Cut Soft Tissue (Cardinal Health). Втора чернодробна биопсия беше взета от лица, които се върнаха за по-нататъшна несвързана операция в последващ момент.

Събиране на данни и диагностика на T2DM

Клиничните данни за всички пациенти са събрани преди операция на RYGB и включват: тегло, височина, индекс на телесна маса, гликиран хемоглобин (HbA1c), плазмена глюкоза на гладно и плазмен инсулин на гладно. Диагнозата на T2DM е установена чрез 1) предварително документиране на диагнозата и/или получаване на лечение за T2DM или 2) диагноза, основана на орален тест за толерантност към глюкоза (OGTT), рутинно провеждан при всички пациенти без известна анамнеза за диабет. По-нататък лицата с T2DM бяха класифицирани като: неразпознати досега, контролирани с диета, нуждаещи се от орални хипогликемични лекарства или прием на инсулин. За тези лица, които са имали втора чернодробна биопсия, теглото, индексът на телесна маса, HbA1c, плазмената глюкоза на гладно и плазменият инсулин на гладно са измерени в рамките на 2 месеца след втората операция. Ремисията на T2DM е определена съгласно препоръките на Buse et al. (HbA1c% -ΔΔCt). Като референтен ген беше използвана еукариотна 18S рРНК (4319413E, Applied Biosystems). Съотношението на INSRB: A се изчислява чрез разделяне на стойностите на INSRB 2 -ΔCt на стойността на INSRA 2 -ΔCt.

INSR изоформа свръхекспресия

PcDNA3.1 + вектор, съдържащ INSRB кДНК (любезен подарък от лабораторията на Р Роналд Кан, Център за диабет Joslin, Бостън, САЩ) е използван за свръхекспресия на INSRB изоформа в HepG2 клетки (American Type Culture Collection, ATCC номер: HB-8065, Манасас, VA, САЩ). PCMV6-XL4 вектор (OriGene Technologies), съдържащ INSRA кДНК клон е използван за свръхекспресия на INSRA. Празният pcDNA3.1 + вектор (Life Sciences) беше използван като контрола.

HepG2 клетки се поддържат в модифицираната орелова среда на Dulbecco (DMEM), допълнена с 10% фетален телешки серум (Life technologies, NZ) и антибиотик/антимикотик (пеницилин 100 единици/ml, стрептомицин 100 μg/ml и фунгизон 0,25 μg/ml) (Life Technologies) ) при 37 ° C и 5% CO2. Клетките се трансфектират при 1 х 105/ямка в 24 ямкова плака (Corning), като се използва разклонен полиетиленимин [41,42] (Sigma Aldrich) и Opti-MEM (Life Technologies). Клетките се серум гладуват 24 часа преди експериментална манипулация.

AKT фосфорилиране

PCK1 RT-qPCR

Клетките бяха стимулирани с 1 μM инсулин в продължение на 12 часа (модифициран от [43]). PCK1 TaqMan Assay on Demand (Hs00159918_m1) (Applied Biosystems) беше използван за анализ на нивата на PCK1 mRNA. Екстракцията на РНК, синтезът на cDNA и RT-qPCR се извършват, както е описано по-горе. Клетките, които не са лекувани с инсулин (изходно ниво), се провеждат паралелно. Като референтен ген беше използвана еукариотна 18S рРНК (4319413E, Applied Biosystems).

Статистически анализ

Извършен е статистически анализ на 2 -ΔCt RT-qPCR данни. Данните за генната експресия се изразяват като log2 пъти промяна в графична форма, докато процентната промяна за значителни разлики се отчита в текста. Нормалното разпределение на всички групи за сравнение беше тествано с тест на D’Agostino-Pearson. Ненормално разпределените данни бяха трансформирани в дневник, за да отговарят на параметричните предположения за теста. Предварителните сравнения бяха извършени с помощта на сдвоен t-тест. Т-тестът на Student беше използван за тестване на значимостта между две групи. Коефициентът на корелация на продукт-момент на Пиърсън е използван за тестване на силата и значимостта на връзката между променливите. Един начин ANOVA с post hoc тест на Tukey се използва за тестване на значимостта между множество групи. Като праг на значимост беше зададена алфа от 0,05. Всички анализи бяха извършени с помощта на Minitab15. Графичната визуализация беше извършена с помощта на GraphPad Prism 5.

Резултати

Чернодробна INSRB: Съотношение на иРНК в NGT и T2DM групи при RYGB

Изследвахме експресията на чернодробна INSRA и INSRB иРНК при индивиди с T2DM (група T2DM) и без (група NGT). Таблица 1 показва антропометрични данни и метаболитни характеристики на групите NGT и T2DM по време на операцията на RYGB. Всички индивиди са боледували със затлъстяване преди операцията (ИТМ> 40 kg/m 2) и не е имало статистически значими разлики в ИТМ между никоя от групите. Според определението, групата T2DM е имала значително по-висок HbA1c% (p Фиг. 1. Съотношение на експресия на mRNA на инсулиновия рецептор A и B в чернодробна тъкан на пациенти със затлъстяване при RYGB и след.

(A) INSRB: Съотношение при операция на RYGB (NGT: Нормален глюкозен толеранс, n = 19; T2DM: диабет тип 2, n = 27). (B) Корелация на продукт-момент на Pearson на INSRB на черния дроб: Съотношение (log) спрямо BMI (log) (n = 46). (C) INSRB: Съотношение при операция на RYGB и след (rsNGT ●: повторете операцията нормален глюкозен толеранс, n = 8; rsT2DM ○: повторете операция диабет тип 2, n = 8). (D) Промяна на INSRA и INSRB сгъване на израза след RYGB, като се използват нива на изразяване RYGB като базова линия. Данните са представени като Средно + SE.

Чернодробна INSRB: Съотношение на иРНК при операция на RYGB и след това при лица със и без диабет

Също така изследвахме експресията на INSRA и INSRB иРНК при лица, които имаха нормален глюкозен толеранс (rsNGT) или T2DM (rsT2DM) при операция на RYGB и при втора несвързана операция. Таблица 2 изброява метаболитните характеристики около времето на първата и втората чернодробна биопсия. От 16 лица, които са имали втора чернодробна биопсия, двама са имали непълни последващи данни. Няма статистически значими разлики в ИТМ между двете групи нито при операция, нито в загубеното тегло, като по този начин загубата на тегло се премахва като потенциален объркващ фактор. Групата rsT2DM имаше значително (p Фиг. 2. AKT фосфорилиране в клетки, свръхекспресиращи INSR изоформа A или B.

(А) AKT фосфорилиране на 9 биологични репликации в продължение на три дни. * Има статистически значима разлика в AKT фосфорилирането между клетките свръхекспресиращи INSRB в сравнение с празни векторни трансфектирани клетки (Tukey, p = 0,025) и INSRA свръхекспресиращи клетки (Tukey, p = 0,03). (B) Представително уестърн блот на AKT фосфорилиране в клетки HepG2, свръхекспресиращи INSRA (HepG2-INSRA) или INSRB (HepG2-INSRB) след лечение с инсулин. За всички Western blots вижте S1 Фиг. Данните са представени като Mean + SE.

Също така изследвахме ефекта от свръхекспресията на INSR изоформите върху индуцираното от инсулина потискане на експресията на PCK1 като маркер за регулиране на глюконеогенезата в чернодробните клетки (Фиг. 3). Клетките, трансфектирани с празен вектор, имат 50% намаление на експресията на PCK1 иРНК след лечение с инсулин. HepG2 клетките, свръхекспресиращи INSRB изоформа, са имали 90% намаление на експресията на PCK1 иРНК след лечение, докато инсулинът не е имал ефект върху HepG2 клетките, свръхекспресиращи INSRA. Освен това свръхекспресирането на INSRA изглежда намалява базалното ниво на експресия на PCK1, въпреки че това не достига статистическа значимост. Взети заедно, тези данни предполагат, че INSRB, а не INSRA, е по-важен при регулирането на инсулин-медиираната глюкозна хомеостаза.

EV групата се трансфектира с празен вектор. Данните са представени като Средно + SE.

Дискусия

Съотношението изоформа на инсулиновия рецептор се определя чрез алтернативно сплайсиране на INSR иРНК с пълна дължина. Изоформата на INSRA се формира чрез сплайсинг на екзон 11, докато изоформата на INSRB включва всички екзони. Двете изоформи имат различни сигнални характеристики, като се смята, че INSRB е по-важна при инсулин-медиираната метаболитна сигнализация. Следователно, INSRB преобладава в метаболитно активната тъкан като черния дроб. Промените в алтернативното сплайсинг променят INSRB: Съотношение, без да се засяга непременно глобалната рецепторна транскрипция. Установихме, че INSRB на черния дроб: Съотношението е по-ниско при лица със затлъстяване с T2DM и се увеличава от 5,4 на 8,6 при пациенти с ремисия на диабет.

Въпреки че нашите in vitro резултати подчертават важността на INSRB: Съотношение в инсулиновата резистентност, клиничното значение и дали отмененото INSRB: A съотношение допринася за инсулиновата резистентност или резултатите от него остава неизвестно. Освен това, въпреки че затлъстяването и диабетът оказват влияние върху INSRB: съотношение, точните стимули, които регулират алтернативното снаждане на INSR, все още са неизвестни. Въпреки че би било желателно да се представят данни за относителното изобилие на нивата на изоформен протеин, заешкото поликлонално антитяло, което отгледахме срещу пептида, съответстващ на екзон 11 на INSRB, не беше специфично, най-вероятно поради относително малкия размер на екзон 11 (12 аминокиселини). Независимо от това, вече е показано, че нивата на mRNA на изоформа на INSR отразяват относителните нива на двата протеина на клетъчната повърхност в мускулната тъкан [54].

подкрепяща информация

S1 Фиг. Всички петна, използвани за количествено определяне на AKT фосфорилиране в клетки, свръхекспресиращи INSR изоформа A или B.

Проведени са три различни експеримента в биологични три повторения, общо 9 повторения на експериментално състояние. HepG2 клетките бяха трансфектирани с празен вектор (контрола), INSRA или INSRB вектор и третирани с инсулин. Контролите без инсулин бяха заредени в съседство с лекуваните с инсулин клетки. Номерирането обозначава експерименти, направени в отделни дни и биологични повторения. Например, HepG2 INSRA 1.1 е експеримент 1 и биологично повторение 1. Вертикалните линии означават отделни петна. За съответните неразрязани уестърн петна вижте фигури S2 – S4.

S2 Фиг. Неизрязани уестърн петна, използвани за количествено определяне на AKT фосфорилиране от експеримент 1.

След прехвърляне мембраната се нарязва в съответствие с молекулното тегло, за да се позволи едновременно сондиране на инсулиновия рецептор β-субединица, актин и фосфорилиран AKT. Частта от мембраната, изследвана за p-AKT, беше отстранена и повторно изследвана за обща AKT на следващия ден. За различните антитела бяха използвани различни експозиции поради силата на сигнала.

S3 Фиг. Неизрязани уестърн петна, използвани за количествено определяне на фосфорилирането на AKT от експерименти 2 и 3.

След прехвърляне мембраната се нарязва в съответствие с молекулното тегло, за да се позволи едновременно сондиране на инсулиновия рецептор β-субединица, актин и фосфорилиран AKT. Частта от мембраната, изследвана за p-AKT, беше отстранена и повторно изследвана за обща AKT на следващия ден. За различните антитела бяха използвани различни експозиции поради силата на сигнала.

S4 Фиг. Неизрязани уестърн петна, използвани за количествено определяне на фосфорилирането на AKT от експеримент 3.

След прехвърляне мембраната се нарязва в съответствие с молекулното тегло, за да се позволи едновременно сондиране на инсулиновия рецептор β-субединица, актин и фосфорилиран AKT. Частта от мембраната, изследвана за p-AKT, беше отстранена и повторно изследвана за обща AKT на следващия ден. За различните антитела бяха използвани различни експозиции поради силата на сигнала.

S5 Фиг. Порция антитела, използвани заедно с MagicMark XP Western Protein Standard.

Петно от фосфорилиран AKT (молекулно тегло: 62 kda), което не показва видима лента без лечение с инсулин и видима лента с лечение с инсулин на 5 и 10 минути. (Б). Пълна обща AKT (молекулно тегло: 62 kda). (C) Блоти на β-субединица на инсулиновия рецептор (молекулно тегло: 95 kda) и актин (молекулярно тегло: 42 kda) от HepG2 клетъчен лизат.

Принос на автора

Замислени и проектирани експерименти: VB HS MH. Изпълнява експериментите: VB. Анализирани данни: VB MH. Реактиви/материали/инструменти за анализ, допринесени: VB MH RS. Написа хартията: VB MH. Помощ при клониране: HS.