Ключова лаборатория за запазване и използване на генетични ресурси на животни на платото Цинхай-Тибетско плато на Министерството на образованието,

фактор-1

Колеж по наука и технологии за живота, Югозападният университет за националности,

№ 16, южна част 4, Първи околовръстен път, Ченгду, 610041, (ПР Китай);

Тел. + 86-28-85522310, E-Mail [email protected]

Сродни статии за „“

  • Facebook
  • Twitter
  • LinkedIn
  • електронна поща

Резюме

Въведение

Затлъстяването е основен рисков фактор за развитието на инсулинова резистентност и прогресирането на диабет, сърдечно-съдови заболявания и други съпътстващи заболявания [1]. Разглежда се като състояние на хронично нискостепенно системно възпаление поради инфилтрация на активирани макрофаги в мастната тъкан [2, 3]. Многобройни проучвания подчертават, че хроничното възпаление свързва излишните мазнини с метаболитните нарушения [3, 4]. Макрофагите на мастната тъкан произвеждат редица провъзпалителни цитокини, които значително променят функцията на адипоцитите, предизвиквайки натрупване на липиди [5], възпалителни реакции [6] и намалявайки инсулиновата чувствителност [7]. Идентифицирането на основните фактори, които медиират вредните ефекти на адипоцитите, може да предложи потенциални терапевтични цели.

Allograft възпалителен фактор-1 (AIF-1) е свързан с калций свързващ възпаление протеин на скеле, произведен главно от имунни клетки [8]. За първи път е идентифициран в активирани макрофаги в сърдечни алотрансплантати на плъхове с хронично отхвърляне (номер за присъединяване на GenBank U17919) [9]. Няколко други молекули като daintain [10], йонизиран Ca 2+-свързващ адаптер (Iba1) [11] и микроглия отговор фактор 1 (MRF-1) [12] са хомолози на AIF-1. AIF-1 е признат за решаваща молекула за оцеляването и провъзпалителната активност на макрофагите [13, 14]. По този начин той участва във възпаление и имунни отговори, свързани с васкулопатия [15], автоимунни заболявания [16] и увреждане на централната нервна система (ЦНС) [17] и др.

Наскоро няколко доклада посочиха участието на AIF-1 в затлъстяването. Първо, единичен нуклеотиден полиморфизъм в генния регион AIF-1 е свързан с телесното тегло [18]. Второ, AIF-1 -/- мишките бяха защитени от затлъстяване, предизвикано от диета [19]. Трето, AIF-1 беше предложен като нов адипокин, произведен главно от макрофаги в човешката бяла мастна тъкан. Експресията му е повишена при затлъстели пациенти и положително корелира с инсулиновата резистентност [20]. Въз основа на тези констатации, ролята на AIF-1 в индуцираната от макрофагите сигнална чувствителност на адипоцитите е изследвана в настоящото проучване, използвайки миши RAW264.7 макрофаги и 3T3L1 адипоцити.

Материали и методи

Изграждане и трансфекция на вектори

Маслено червено O анализ

Предварителни адипоцити на миши 3T3L1 също са получени от ATCC и са отгледани в DMEM с 10% FBS и 1% пеницилин/стрептомицин при 37 ° С във овлажнена атмосфера от 5% CO2. Пред-адипоцитите бяха диференцирани в адипоцити, както описахме по-рано [21]. Накратко, 2 дни след сливането (ден 0), клетките бяха индуцирани да се диференцират чрез DMEM, допълнен с 10% FBS, 0,5 mmol/L 3-изобутил-1-метил-ксантин, 0,25 µmol/L дексаметазон и 10 µg/ml инсулин ( MDI, Sigma, Сейнт Луис, Мисури, САЩ) за още 2 дни. На 4-ия ден клетките бяха прехвърлени в среда, кондиционирана в макрофаги и 10 ug/ml инсулин за още два дни. Вътреклетъчното натрупване на липиди на адипоцити на 3T3L1 се наблюдава чрез визуалното появяване на мастни капчици в клетките и маслено червено О петно. Интегрираната оптична плътност (IOD) на липидните капчици е използвана за количествено определяне на липидното натрупване [22].

Измерване на реактивни кислородни форми и отделяне на адипокин

Предиадипоцитите на миши 3T3L1 бяха напълно диференцирани в адипоцити, използвайки стандартен протокол [21]. По-конкретно, 2 дни след като клетките достигат сливане, те се инкубират в диференциращата среда (DMEM, допълнена с 10% FBS и адипогенен коктейл MDI) в продължение на 2 дни. След това клетките се поддържат в DMEM, съдържащ 10% FBS и 10 ug/ml инсулин в продължение на още 2 дни, и се допълват с DMEM, съдържащ 10% FBS, до пълна диференциация в адипоцити. След това средата беше заместена с кондиционирана в макрофаги среда или 0, 0.1, 1, 10 nmol/L AIF-1 [16] в DMEM, допълнена с 10% FBS за 2 дни. Клетките се събират чрез центрофугиране при 500 g в продължение на 5 минути и се лизират. Производството на реактивни кислородни видове в адипоцитите на 3T3L1 се измерва с клетъчен комплект за анализ за откриване на реактивни кислородни видове (Sigma, Сейнт Луис, МО, САЩ) и се анализира с поточен цитометър (Beckman Coulter FC500, Brea, CA). Концентрациите на секреция на тумор некротизиращ фактор-алфа (TNF-α), интерлевкин 6 (IL6), резистин и адипонектин от адипоцити и базалните нива на TNFα, IL6 в среда, кондиционирана в макрофаги, бяха определени с помощта на съответните ELISA комплекти (R&D системи, Абингдън, Великобритания).

Консумация на глюкоза

Консумацията на глюкоза беше изследвана, както беше описано по-рано [23]. Диференцираните 3T3L1 адипоцити бяха изложени в продължение на 18 часа на DMEM, съдържащ 10% FBS и или 5 mmol/L, или 25 mmol/L глюкоза, със или без 0.6 nmol/L инсулин, както е посочено. След това клетките се инкубират в кондиционирана в макрофаги среда или 0, 0.1, 1, 10 nmol/L AIF-1 в DMEM с 10% FBS в продължение на 48 часа. Преди изследването клетките се стимулират със 100 nmol/L инсулин в продължение на 30 минути и концентрацията на глюкоза в хранителната среда се анализира, използвайки метода на глюкозната оксидаза.

Уестърн петно

Статистически анализ

Данните бяха изразени като средни стойности ± стандартна грешка на средната стойност (SEM). Данните бяха анализирани статистически, като се използва софтуерът SPSS Statistics V17.0 и значимостта на разликите между съответните групи беше определена чрез ANOVA, последвано от едно опашно множество t-тестове. Стойност на P