1 Ключова лаборатория за изследване и иновации на генетични ресурси от селскостопански животни в провинция Съчуан, Колеж по животновъдни науки и технологии, Сечуански селскостопански университет, Ченгду 611130, Китай

увеличаването

Резюме

Коренът на Angelica sinensis (RAS) е традиционно китайско лекарство, използвано за профилактика и лечение на различни заболявания. В това проучване ние оценихме ефектите на RAS добавки върху телесното тегло и FTO генна експресия и статус на метилиране в модел на затлъстела мишка, индуциран с високо съдържание на мазнини (HFD). Женските затлъстели мишки бяха разделени на групи според дозировката на RAS в диетата, както следва: нормална диета, HFD диета (HC), HFD с ниска доза RAS (DL), HFD със средна доза RAS (DM) и HFD с висока дозировка RAS (DH). След добавяне на RAS в продължение на 4 седмици, потискане на телесното тегло и FTO експресията при DH мишките е значително по-висока, отколкото при HC мишките, докато няма значителна промяна в FTO експресия се открива между DM и DL мишки или в тяхното потомство. PCR за последователност на бисулфитите (BSP) разкри, че островът CpG в FTO промоторът е хиперметилиран до 95,44% в HC групата, 91,67% в DH групата и 90,00% в нормалната диетична група. Хистологичното изследване показа, че адипоцитите в DH групата са по-малки от тези в HC групата, което показва потенциална роля на RAS при затлъстяване. Това проучване показва, че RAS може да подобри затлъстяването, индуцирано от HFD и че молекулярният механизъм може да бъде свързан с експресията на FTO ген.

1. Въведение

Затлъстяването е световен приоритет за здравето и резистентността към индуцирано затлъстяване е изследвана в много животински модели. Диета, богата на захар и съдържаща до 45% мазнини, се използва широко за предизвикване на затлъстяване при мишки [1–3]. Учените са открили, че някои китайски билки като берберин, куркума лонга и Sibiraea angustata може ефективно да подобри затлъстяването чрез инхибиране на синтеза, растежа и натрупването на мастна киселина в адипоцитите [4–6]. Функциите на китайските билки са изследвани in vivo при модели на мишки със затлъстяване, индуцирано с високо съдържание на мазнини (HFD) [7].

Коренът на Angelica sinensis (Китайски на име Danggui), добре познато билково лекарство, в миналото се е използвало като транквилизатор или тонизиращо средство [8, 9]. Като функционална храна, RAS може да се използва и за подобряване на възпалението, диабета и сърдечно-съдовите заболявания. Предишни проучвания показват, че Angelica sinensis полизахаридът (ASP), активните химични компоненти на RAS, имаше хематопоетични ефекти при животински и клетъчни модели [10]. Два киселинни полизахариди (APS-3b и APS-3c) значително инхибираха растежа на тумори S180 и увеличиха продължителността на живота на мишки, носещи тумор S180 [11]. Освен това антиоксидантните ефекти на ASP биха могли да стимулират ендотелното производство на азотен оксид и да устоят на увреждане на исхемия/реперфузия (I/R) [12].

Масната маса и затлъстяването, свързани (FTO) генът има относително въздействие върху затлъстяването [13]. FTO се намира на хромозома 16 при хора и кодира протеин с двойно верижна b-спирална гънка, хомологичен на членовете на нехема и 2-оксоглутарат оксигеназа суперсемейство (които влияят главно върху метаболизма на мастната киселина) [14]. Освен това проучванията при хора и гризачи предполагат това FTO участва в регулирането на приема на храна и метаболизма на липидите [15]. Хистологичните изследвания разкриват, че локализацията на FTO иРНК и протеини в ядрото на хипоталамуса са от решаващо значение за регулирането на приема на фураж при мишки [16]. Загуба на функция на FTO при мишки доведе до забавяне на растежа след раждането и значително намаляване на мастната тъкан и чистата телесна маса [17]. Свръх израз на FTO, обаче, доведе до дозозависимо увеличаване на телесната и мастната маса [18]. Освен това Меркещайн и колегите установиха това FTO влияе на адипогенезата чрез регулиране на процеса на митотично клонално разширение при затлъстели мишки [19].

В настоящото проучване оценихме ефектите от добавянето на RAS върху телесното тегло при HFD мишки. Освен това, експресията на иРНК и статутът на метилиране на промотора на FTO гена бяха определени, за да се сравнят ефектите на RAS между контролната и третираната група. Това проучване ще осигури основа за разбиране на функциите на RAS при резистентност към затлъстяване.

2. Материали и методи

2.1. Декларация за етика

Животните, участващи в това проучване, са жертвани в съответствие с Правилника за администриране на въпроси, свързани с експериментални животни и одобрени от Институционалния комитет по грижа и употреба на животните в Колежа по животновъдни науки и технологии, Сечуански земеделски университет, Съчуан, Китай, под номера на разрешителното DKY-B20110807.

2.2. Животни и диети

Женски KM мишки на 5-седмична възраст са получени от Chengdu Dossy Laboratory Animal Co., Ltd, в провинция Съчуан, Китай. Мишките се отглеждат при стандартни условия в рамките на свободен достъп до храна и вода в продължение на 1 седмица, за да се аклиматизират в експериментални условия. След това мишките бяха разпределени на случаен принцип в нормалната диетична група (GC,

) или HFD групата (HC,

) без добавяне на RAS. След 5 седмици затлъстелите мишки бяха разделени на случаен принцип в четири групи. Всички групи бяха непрекъснато хранени с HFD. Първата група (

) е определена като контролна група с високо съдържание на мазнини (HC) без добавяне на RAS. Втората група () получи RAS добавки при 2,00 g/kg · BW и беше определена като група с ниски дози (DL). Третата група () получи RAS добавка при 5.00 g/kg · BW и беше определена като група със средни дози (DM), а последната група () беше определена като група с високи дози (DH) с добавка на RAS при 10.00 g/kg · BW. Женските потомци са получени чрез чифтосване с мъжкия КМ, хранен при същите условия за всяка група. Диетичната формула е показана в Таблица 1. RAS се изсушава и смила и след това се добавя към сместа, която се омесва и се прави в цилиндрична форма с помощта на 5-ml инжектори. Накрая, сместа се суши при 60 ° С за една нощ и се съхранява в херметичен плик след охлаждане до стайна температура. Теглото на тялото се измерва седмично. Мастните тъкани бяха събрани от 4 мишки във всяка група след добавяне на RAS за 35, 60 и 95 дни.

2.3. Общо извличане на РНК и обратна транскрипция

Мишките се умъртвяват чрез дислокация на шийката на матката и мастната тъкан се събира и бързо се замразява в течен азот и след това се съхранява при -80 ° C. Общата РНК се екстрахира с помощта на TRIzol реагент (Invitrogen, СА, САЩ). Чистотата на изолираната РНК се определя чрез електрофореза в агарозен гел и концентрацията се определя количествено от ND-2000 Nanodrop (Thermo Scientific, МА, САЩ). cDNA е синтезирана с помощта на реактивния комплект Prime Script RT (Takara, Dalian, Китай) съгласно препоръките на производителя.

2.4. Количествена PCR в реално време на FTO Ген

Извършихме количествена PCR в реално време (qPCR), за да определим количествено относителните нива на експресия на иРНК на FTO в мастните тъкани на мишки от GC, HC, DL, DM и DH групи, както и DH потомство. Двойките праймери, използвани за qPCR (Таблица 2), са проектирани според мишката FTO ген (NM_011936). QPCR се извършва в три екземпляра, като се използва комплект SYBR® Premix Ex Taq ™ II (Takara, Dalian, Китай). Всяка qPCR реакция (общ обем 10 μL) съдържа 0,8 μL cDNA, 5 μL SYBR Green II, 0,8 μL двойки праймери и 3.4 μL ddH2O. Процедурите на qPCR са както следва: 95 ° C за 3 минути, 40 цикъла от 95 ° C за 10 s, 30 s при оптимални температури, 72 ° C за 10 s и окончателно удължаване за 5 min, и след това нарастване на температурата от 0,5 ° C/s от 65 ° C до 95 ° C за изграждане на крива на топене. Специфичността на qPCR продуктите е потвърдена чрез анализ на кривата на топене. Относителният израз на FTO тРНК беше определена като се използва геометричната средна стойност на GAPDH,

-актин, и 18s рРНК по

2.5. Приготвяне на ДНК и анализ на метилиране по BSP метод

Геномната ДНК се извлича от мастните тъкани на мишки от GC, HC и DH групи след добавяне на RAS в продължение на 35 дни, като се използва TIANamp Genomic DNA Kit (Tiangen, Пекин, Китай). Три животни бяха избрани на случаен принцип от всяка група. ДНК се определя количествено от ND-2000 Nanodrop и след това се третира с натриев бисулфит, като се използва EZ DNA Methylation Gold Kit (Zymo Research, CA, USA). Следвайки инструкциите на производителя, дозировката на ДНК беше строго ограничена, за да се осигури пълно превръщане на цитозин в урацил.

Метилираните CpGs в FTO промотор (Acc. номер AC105989) са оценени от онлайн програмата (http://www.urogene.org/cgi-bin/methprimer/methprimer.cgi). Двойките грундове са модифицирани от Primer Premier 5 (Таблица 2). PCR се провежда на C1000 PCR система Thermocycler (Bio-Rad, Richmond, CA) в обем 30 μL, включително 1 μL бисулфит-преобразувана ДНК или 0,5 μL PCR продукти, 15 μL Zymo Taq ™ PreMix или 1 μL двойки грундове. PCR реакциите са както следва: 95 ° C за 5 минути, 40 цикъла от 30 s при 95 ° C, 30 s при 65,2 ° C (втори кръг: 57,5 ​​° C) и 30 s при 72 ° C, и окончателно удължаване за 7 минути при 72 ° С. Вторите PCR продукти се пречистват с комплект за екстракция на ДНК гел (TsingKe, Chengdu, Китай) и след това се лигират в pMD 19-T вектор (Takara, Dalian, Китай). Най-малко десет положителни рекомбинанта бяха секвенирани на ABI 3730XL ДНК анализатор (Applied Biosystems, САЩ). Метилираните CpGs бяха анализирани с инструмента за количествено определяне (QUMA, http://quma.cdb.riken.jp/).

2.6. Хистологичен и морфометричен анализ

Коремните мастни тъкани бяха резецирани и фиксирани в 4% параформалдехид след измиване. След това те бяха дехидратирани в етанол и накиснати в диметилбензен и след това вградени в парафин. Блоковете на тъканите се разделят на дебелина 4 микрона и след това се оцветяват с хематоксилин и еозин (H&E) реагент. Фотомикрографиите са получени и анализирани с помощта на софтуера Image-Pro Plus (Media Cybernetics).

2.7. Статистически анализи

Всички статистически анализи бяха извършени с използване на SPSS 20.0 (SPSS, Чикаго, IL, САЩ) и данните бяха представени като средни стойности ± SD. Значимостта между групите е оценена чрез еднопосочен ANOVA тест и Student’s

3. Резултати

3.1. Ефекти от добавянето на RAS върху телесното тегло при HFD Fed мишки

В сравнение с нормалната диетична група (GC), HC мишките показват изразено затлъстяване след хранене с HFD в продължение на 5 седмици (Фигура 1 (а)). По време на лечението с HFD, апетитът, активността и блясъкът на козината бяха нормални за всички животни. След 5 седмици мишките от HC групата бяха разделени на пет подгрупи, HC, DL, DM и DH, хранени с различна доза RAS добавки за още 4 седмици. В сравнение с мишките в GC, HC, DL и DM групите, мишките в DH групата показват най-ниско покачване на теглото (Фигура 1 (b) и Таблица 3). По-късно използвахме 10,00 g/kg · BW RAS за непрекъснато хранене на потомството на DH. Въпреки това, добавянето на RAS не показва очевиден ефект върху телесното тегло между потомството от групите HC и DH (данните не са показани).

3.2. Ефекти от добавянето на RAS върху FTO експресия на иРНК

За да се оценят ефектите от добавянето на RAS върху FTO експресия на иРНК, извършихме qPCR за количествено определяне FTO експресия в мастна тъкан, събрана от мишки в GC, HC, DL, DM и DH групи в дни 35 и 60. В допълнение, ние също определихме FTO експресия в HC и DH мишки на ден 95, както и на тяхното потомство на ден 35. Резултатите от qPCR показват, че експресията на FTO в групите, допълнени с RAS (DL, DM и DH), е значително по-висока, отколкото в групата с HC след 35 d и 60 d (Фигури 2 (a) и 2 (b)). Не е установена значителна разлика между HC и DH групите след 90 d (Фигура 2 (c)). Освен това няма значителна разлика в FTO експресия между потомството на мишки в групите HC и DH (Фигура 2 (d)).

показва значителна разлика ().

3.3. Ефекти на добавката RAS върху метилирането в FTO Промоутър

Структурата на анализираните CpG сайтове и техните местоположения (GenBank Acc. Номер AC105989: 31474–31968) в рамките на FTO гените са показани на Фигура 3. Моделите на метилиране на ДНК на GC, HC и DH групите се оценяват чрез бисулфитно секвениране. Анализираният регион включва дефиниран CpG остров, разположен на 666 bp нагоре от началния кодон. The FTO генът е хиперметилиран при GC мишки (90.00%), докато мишките, хранени с HFD, показват по-високо ниво на метилиране в HC групата (95.44%). Както се очаква, добавянето на RAS намали нивото на метилиране, което достигна 91,67% при DH мишки.

3.4. Ефекти на добавката RAS върху морфологията на адипоцитите

Хистологичното изследване на H&E показа, че адипоцитите имат полигонална морфология с типични периферно разположени ядра и отчетливи клетъчни граници (Фигура 4 (а)). След хранене с HFD с добавка RAS в продължение на 35 d, обемът на адипоцитите в DH групата е по-малък от този в HC групата и показва известна фиброзна тъкан в междуклетъчното вещество и по-голям брой адипоцити (Фигура 4 (а)). Адипоцитите в DH мишки, хранени с RAS в продължение на 60 d, отново бяха по-малки и клетъчната подредба очевидно беше ненормална в сравнение с HC мишки. Хистологичните и количествени анализи разкриват, че средният диаметър на адипоцитите в HC и DH мишките, хранени с RAS за 35 d, е

μm и μm, съответно, и площта на адипоцитите е

μm 2 и μm 2, съответно (Фигура 4 (б)). При DH мишките, хранени с RAS за 60 d, средният диаметър и площ на адипоцитите са μm и μm 2, съответно. Като цяло средният диаметър и площ на адипоцитите при HC мишки са значително по-големи, отколкото при DH мишки ().

4. Дискусия

В този доклад ние демонстрираме за първи път благоприятните ефекти на добавката RAS върху телесното тегло, генната експресия и промоторното метилиране на FTO ген при мишки с HFD затлъстяване. Както много предишни проучвания, моделът на затлъстяване при мишки се индуцира от HFD; докато формулите се различават между проучванията, общите съставки включват захар и свинска мас [1, 2]. Моделът на мишките със затлъстяване е установен чрез HFD и е акредитирано стандартното отклонение както в GC, така и в HC групите. Вътрешногруповите несъответствия в телесното тегло след прилагането на RAS може да се дължат на индивидуална грешка [8, 21]. В настоящото проучване повишаването на телесното тегло е най-ниско в DH групата, която е получила 10,00 g/kg · BW от добавка RAS (Таблица 3). Междувременно повишаването на телесното тегло при мишките, хранени с ниска или умерена доза (DL и DM групи) не се различава от HC мишките, което показва, че по-високата доза добавка на RAS (10,00 g/kg · BW) може да бъде по-полезна за потискане телесно тегло при затлъстели индивиди.

Установихме, че изразът на FTO mRNA беше значително увеличена при RAS-допълнени мишки (DL, DM и DH групи) и наддаването на телесно тегло на HC мишки беше значително по-високо от това на DL, DM и DH мишки. Това предполага, че RAS може да повлияе на печалбата на BW чрез промени в генната експресия. Както показа qPCR, имаше значителна разлика в FTO експресия между RAS-допълнени групи и GC и HC групи за 35 дни, което предполага корелация между FTO експресия и наддаване на телесно тегло. При HC мишки обаче, FTO изразът е най-нисък, а затлъстяването - най-високо. Предишни проучвания съобщават, че загубата на FTO при мишки доведе до значително намаляване на мастната тъкан и чистата телесна маса [17] и това FTO повлиял адипогенезата чрез регулиране на събитията в началото на адипогенезата по време на процеса на митотична клонална експанзия [19]. FTO mRNA е по-силно експресирана в групи, третирани с RAS, отколкото контролната група, особено DH групата. След 60 d, най-високата FTO нивото на експресия беше в групите, лекувани с RAS. Нещо повече, не се наблюдава значителна разлика след 95 дни между GC и HC групите, нито в тяхното потомство. Тези резултати предполагат, че ефектите от добавянето на RAS върху FTO израз не са наследствени.

FTO е деметилаза на нуклеинова киселина, която премахва метиловите групи както от ДНК, така и от РНК [16, 22]. Предишни проучвания показват, че метилирането на ДНК се променя не само в ооцитите на затлъстели мишки, но и в техните потомци [23]. Модификацията на метилирането на ДНК осигурява връзка между околната среда и генната експресия, следователно ние изследвахме нивата на метилиране на CpGs в FTO промоторен регион. Съществуват 15 CpG динуклеотиди, присъстващи в 2 Kb нагоре от стартовия кодон на FTO. Резултатите от BSP показаха, че CpG сайтовете в рамките на FTO промоторите са силно метилирани във всичките три групи (GC, HC и DH). Въпреки че нивата на метилиране не се различават значително, нашите резултати разкриват, че метилирането и експресията на промотор на FTO генни тРНК са отрицателно корелирани. По този начин е възможно регулиране от метилова група, блокираща свързването на транскрипционния фактор към този регион (AC105989: 31,474–31,968 bp).

Предишно проучване демонстрира полизахарида на Angelica sinensis за подобряване на нарушенията на глюкозния и липидния метаболизъм, свързани със затлъстяването, вероятно поради взаимодействия с инсулин и серумни възпалителни фактори [8]. Молекулярните механизми обаче останаха неясни. В настоящото проучване степента на мастните тъкани е различна между HC и DH мишки. Предполагаме, че тази разлика в телесното тегло може да се дължи на морфологията на адипоцитите. Освен това извършихме хистологично изследване, за да видим промените във формата и размера на адипоцитите между мишки HC и DH. Както е показано на Фигура 4, адипоцитите в HC групата са по-зрели и се характеризират с по-големи липидни капчици, докато тези в DH имат повече и по-малки липидни капчици. Мишките от DH групата, хранени с RAS в продължение на 60 d, показват много по-малки адипоцити и повече междуклетъчно вещество, отколкото DH мишки, хранени с RAS за 35 d.

5. Заключение

Това проучване изследва дали RAS може да потисне телесното тегло при HFD затлъстели мишки. Добавянето на RAS е свързано с потискане на повишеното телесно тегло FTO експресия на иРНК и намаляване на метилирането. Настоящото проучване предоставя нова представа за биологичната роля на RAS. Необходими са допълнителни подробни анализи, за да се разбере механизмът на RAS при потискане на телесното тегло.

Конфликт на интереси

Всички автори заявиха, че нямат конфликт на интереси.

Благодарности

Това проучване беше подкрепено от безвъзмездните средства от Бакалавърската програма за иновативни експерименти на Земеделския университет в Съчуан (201410626007), Националната фондация за естествени науки на Китай (31301945) и Инфраструктурата на ресурсите на китайските зародиши за домашни животни.

Препратки