Присъединителен отдел по химия и химическа биология, Университет Макмастър, Хамилтън, Онтарио, Канада

магнитозомни

Партньорска школа по науки за живота, Университет на Невада в Лас Вегас, Лас Вегас, Невада, Съединени американски щати

Присъединителен отдел по химия и химическа биология, Университет Макмастър, Хамилтън, Онтарио, Канада

  • Саманбир С. Калирай,
  • Денис А. Базилински,
  • Адам П. Хичкок

Фигури

Резюме

Цитат: Kalirai SS, Bazylinski DA, Hitchcock AP (2013) Аномални магнитни ориентации на магнитозомни вериги в магнитотактична бактерия: Magnetovibrio blakemorei щам MV-1. PLoS ONE 8 (1): e53368. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0053368

Редактор: Джош Нойфелд, Университет на Ватерло, Канада

Получено: 1 септември 2012 г .; Прието: 30 ноември 2012 г .; Публикувано: 8 януари 2013 г.

Финансиране: CLS се поддържа от канадската фондация за иновации (CFI), NSERC, канадските институти за здравни изследвания (CIHR), Националния съвет за научни изследвания (NRC) и университета в Саскачеван. DAB се подкрепя от безвъзмездната помощ на Националната научна фондация на САЩ (NSF) EAR-0920718. ALS се подкрепя от директора, Служба за енергийни изследвания, Служба за основни енергийни науки, Отдел за науките за материалите към Министерството на енергетиката на САЩ, съгласно договор № DE-AC02-05CH11231. Финансистите не са играли роля в дизайна на проучването, събирането и анализа на данни, решението за публикуване или подготовката на ръкописа.

Конкуриращи се интереси: Авторите са декларирали, че не съществуват конкуриращи се интереси.

Въведение

Магнитотаксичните бактерии (MTB) са повсеместни в морски и сладководни среди [1], [2], [3]. Те са разнообразна група филогенетично и морфологично, които са свързани със способността да биоминерализират мембранно ограничени магнитни наночастици, наречени магнитозоми. Магнитозомите са еднодоменни магнитни кристали от магнетит, Fe3O4 или от грейгит, Fe3S4 [4], обикновено ориентирани в една или повече вериги. Магнитозомите са отговорни за поведение, наречено магнитотаксис, при което клетките пасивно се подравняват и плуват по линиите на геомагнитното поле на Земята, които са наклонени, с изключение на екватора [5]. Чрез намаляване на триизмерния проблем с търсенето до едно едно измерение, магнитотаксисът позволява на подвижните бактерии по-ефективно да локализират и поддържат позиция в оптимална химическа среда, обикновено оксично-аноксичната граница, във водни местообитания, характеризиращи се с вертикални химикали (напр. кислород) градиенти на концентрация [5]. По този начин в химически стратифицирани местообитания MTB изглежда имат значително предимство пред немагнитотактичните бактерии при намирането на предпочитаната от тях среда [6].

MTB, произвеждащ магнетит, синтезира магнетизирани вериги от общо разположени, кохерентно подравнени магнитозоми, за да се увеличи максимално диполното взаимодействие с магнитното поле на Земята [7], [8], [9]. Способността за възпроизводимо производство на магнитозомни магнетитови кристали с висока химическа чистота, плътно разпределение на размера и еднаква форма представлява изискан процес на биоминерализация [10], [11]. Разпределението на размера на магнитозомните кристали е силно контролирано, за да бъде в рамките на режима за размер на един домейн [11], като по този начин максимизира индивидуалния диполен момент на всяка магнитозома и предотвратява неблагоприятни зависими от размера ефекти като суперпарамагнетизъм и образуване на множество домейни, които елиминират или намаляват ефикасността на магнитната частица.

Има голям интерес към разбирането на биоминерализацията и свързаните с нея процеси както от фундаментална гледна точка, така и за биомиметични приложения [12], [13]. По този начин, малко след първоначалното откритие [14], [15] на магнитотактичните бактерии, започнаха огромни усилия да се разбере в дълбочина явлението и то продължава и днес. Голяма част от усилията за разбиране на биоминерализацията на магнитозомите включват генетични техники, които не само са довели до откриването на гени, участващи в структурата, образуването и организацията на магнитозомите (гените mam, mms и mtx), но и до откриването, че повечето от тези гени са разположени като клъстери в генома, които са допълнително организирани като магнитозомен генен остров [16]. Използвани са техники като трансмисионна електронна микроскопия (TEM), за да се запълни празнината в знанията, свързана с разбирането за ролята на отделните гени mam, както и общо разбиране за растежа на веригите и взаимодействията между отделните магнитозоми във веригата [17].

Тук докладваме проучване, което използва сканираща трансмисионна рентгенова микроскопия (STXM) [23] - [25] и рентгенов магнитен кръгов дихроизъм (XMCD) [26] за определяне на магнитните и химичните свойства на магнитозомните вериги в отделни клетки на магнитотаксичната бактерия Magnetovibrio blakemorei щам MV-1 [27] на индивидуално ниво на магнитозома [28], [29]. Докато повечето предишни проучвания са фокусирани върху вериги с редовно разположени магнитозоми, при които магнитният вектор на всяка магнитозома е подравнен в същата посока като тази на всички други магнитозоми във веригата, ние сме се фокусирали върху клетки, които съдържат подвериги, разделени от пространствени пропуски. MV-1 е избран за модел на организъм поради предишни наблюдения на пространствени пролуки между магнитозомните подвериги в тези клетки [7], [30]. Нашите резултати от STXM-XMCD показват, че за разлика от повечето магнитозомни вериги, изследвани до момента, подверигите, разделени с пролуки в MV-1, могат да имат противоположни магнитни ориентации. Пространствените пролуки се дефинират като пролуки, които са по-големи от 50 nm, което е много по-голямо от типичните разстояния за разделяне на магнитозомите в кондензирани вериги. Нашето проучване на тези случаи дава допълнителна представа за механизмите на формиране на веригите.

Експериментално

STXM-XMCD измервания

Освен това могат да се получат магнитно чувствителни XMCD карти, които представляват разликата в изображенията, записани с всяка поляризация при единична, магнитно чувствителна фотонна енергия. Енергията на фотоните от 708,2 eV, енергията на първия минимум в XMCD спектъра, осигурява максимална магнитна чувствителност в случай на магнетит.

Приготвяне на магнитотактични бактерии

Клетки от щама Magnetovibrio blakemorei MV-1, изследваната магнитотактична бактерия, се отглеждат анаеробно в течни култури с азотен оксид като краен електронен акцептор, както беше описано по-горе [34]. Клетките бяха събрани от култури в средната до късна експоненциална фаза на растеж.

Трансмисионна електронна микроскопия

Клетките се отлагат върху решетки от меден електронен микроскоп със стандартно покритие, измити, за да се отстранят солите на културата, и се преглеждат с електронен микроскоп JEOL Model JEM 1200 EX.

Резултати

Изображението е записано при 709.8 eV и е преобразувано в оптична плътност (OD), като се използва интензивността в области без клетки в това изображение. Стрелките показват клетки с видими пропуски в техните магнитозомни вериги. Въпросните знаци (червени) показват (множество) клетки, които са били намалени поради несигурност относно броя на наличните клетки и/или магнитозомни вериги.

От 150 клетъчна подгрупа от тези 351 клетки, за които е измерен XMCD, имаше 6 клетки, съдържащи две или повече подвериги на магнитозоми с противоположни магнитни полярности, което води до честота на магнитните аномалии от 4,0 ± 0,2% от общата клетка популация и 9,9 ± 0,4% честота по отношение на тези клетки с магнитозомни пропуски във веригата. Магнитните аномалии се дефинират като магнитозомни вериги с поне една празнина с размер на магнитозома във веригата (> 50 nm), като празнината разделя подверигите с противоположна магнитна ориентация.

Фигура 2а показва единична MV-1 клетка, съдържаща характерна прекъсната верига от магнитозоми. Фигури 2b и 2c представят спектрите на рентгеновото поглъщане на Fe 2p3/2 за двете верижни секции и съответно свързаните с тях XMCD сигнали. Спектралните сигнали показват, че има инверсия на магнитния сигнал на единия спрямо другия. Фиг. 2г представя цветно кодиран композит на XMCD сигналите с този за клетъчния материал, визуализиран при 704 eV, под началото на Fe 2p ръба. Тази презентация ясно показва, че магнитната ориентация на верижния участък вляво е противоположна на тази на верижния участък вдясно. Суперпозицията на две клетки с отделни вериги е изключена поради средното изображение от пред-ръба (синьо на фиг. 2г), което е чувствително към клетъчната плътност. Ако в това изображение бяха насложени две клетки, предварителният сигнал в пресечната точка щеше да бъде забележимо по-голям, отколкото в краищата на веригата, където изображението е ясно като на отделна клетка.

(а) STXM изображение (OD). Двете подвериги са обозначени верига 1 и верига 2. Всяка магнитозома е означена a-g. (b) Fe 2p3/2 спектри от лявата верига (горната) и дясната верига (долната), записани с двете кръгови поляризации. (c) XMCD сигнали, получени чрез изваждане на двата кръгови поляризационни спектъра. (г) Цветово кодиран композит на клетката (OD изображение при 704 eV) (синьо), магнитозоми с поляризация вляво (зелено) и поляризация вдясно (червено). Стрелките на фигури (а) и (г) показват „премагнитозома“ - вижте текста.

Fe 2p3/2 спектърът на пролуката между две магнитозомни подвериги (червено); този на незрял, вероятно суперпарамагнитен, магнитозомен кристал (зелен); този на клетъчната цитоплазма (син) и този на единична магнитозома (оранжев) се сравняват в Фигура 3. Това сравнение показва, че в процепа има повече желязо, отколкото в частите на клетката извън магнитозомната верига. Освен това спектралната форма на желязото в процепа се различава от тази на зрелите и незрели магнитозомни кристали магнетит. Сигналите при ∼708 eV и ∼710 eV традиционно се свързват със степента на окисляване на Fe (II) и Fe (III) (въпреки че спектрите на чисти видове Fe (II) и чисти Fe (III) съдържат някакъв сигнал при всяка енергия). Областта на процепа показва по-високо съдържание на Fe (II) от това на зрелия магнитозомен кристал. Fe 2p3/2 спектърът на зрелите магнитозомни кристали съвпада добре с този на референтния магнетит [29]. Спектърът Fe 2p3/2 на незрелия магнитозомен кристал е подобен на този на зрял, но е немагнитен (нула XMCD).

(b) Fe 2p3/2 спектри (средно за лявата и дясната информация за кръговата поляризация) на различни региони на клетката: единична магнитозома (червена), първата празнина (розова), „премагнитозома“ (зелена) и цитоплазмата на клетката (синя) далеч от магнитозомната верига. (в) Разширяване на процепа и предмагнитозомни спектри. Вертикалните линии показват енергии, традиционно свързани със сигналите за състояние на окисляване на Fe (II) и Fe (III).

Фигура 4а показва TEM изображение на цяла непокътната MV-1 клетка, докато Фигура 4Ь е съответното STXM изображение на същата клетка при 709,8 eV. В тази клетка има три магнитозомни подвериги, с пролуки между тях. Картата XMCD на трите подвериги (Фигура 4в) показва, че има противоположна магнитна ориентация между верига 1 и вериги 2 и 3. Това се отразява в обратния смисъл на XMCD спектрите за трите подвериги (Фигура 4г ). Средно сигналът XMCD на верига 1 е по-голям от този на вериги 2 и 3.

(а) TEM изображение на клетката. Правоъгълните тъмни предмети са солни кристали от растежната среда. Прекъснатата бяла линия показва границата на клетката, която съдържа 3 подвериги. (b) STXM изображение при 709,8 eV на идентичния регион. (в) Цветово кодиран композит на XMCD сигнала от магнитозомната верига. (г) XMCD спектри на 3-те подвериги.

Дискусия

Фигура 3в показва, че разпределението на железните видове в процепа има по-голямо съдържание на желязо, Fe (II) от магнетита. Предишни проучвания показват, че формата на желязо, което се транспортира до магнитозомни везикули, за да образува биогенен магнетит, е железен по природа [35], [36], [37]. Всеки транспорт на железно желязо най-вероятно ще включва сидерофори, за да се предотврати утаяването на Fe (III) [38]. Frankel et al. [37] използва 57 Fe Mössbauer спектроскопия, за да изследва същността и разпределението на основните железни съединения в M. magnetotacticum. Те предложиха модел, при който Fe (III) се поема от клетката по неспецифичен начин, редуцира се до Fe (II) при навлизането й в клетката, след което се окислява отново до Fe (III) оксид по време на образуването на магнитозоми. Фактът, че Fe 2p3/2 спектралният подпис, открит в процепа, има по-железен характер от магнитозомите, е в съответствие с това схващане. Този железен сигнал може да бъде от магнитозомен везикул, който или не е успял да утаи магнетит, или е непосредствено преди образуването на магнетит.

Една от възможностите, която би могла да обясни наблюдението, е, че аномалните клетки изпитват силно външно магнитно поле, което е обърнало магнитната ориентация на едната половина на частична верига, без да засяга другата половина. Това е много неправдоподобно, тъй като е необходимо голямо магнитно поле в равнината (∼6.37 × 10 4 A/m), за да обърне момента на кристал от един домен магнетит [9]. Ако пробата беше изложена на външни полета с такава величина, бихме очаквали, че и двете подвериги ще бъдат повлияни по подобен начин. Втората възможност е, че магнитозомната верига е била повлияна от полето на противоположно ориентирана верига в клетка, която е в непосредствена близост. Обаче полето, генерирано от магнитозомна верига, външна за клетката, е твърде слабо, за да модифицира намагнитването на магнитозомите в съседна клетка поради голямото поле на вътреклетъчните вериги и бързия спад на силата на магнитното поле с увеличаване на разстоянието. Преди това беше установено, че принудителната сила на полето от 1,90 × 10 3 до 2,85 × 10 3 A/m е необходима за превключване на полярността на верига MV-1 от 15 магнитозоми [7]. Това обаче може да варира, тъй като принудителните полета на магнитозомните вериги са функция от дължината на веригата, разстоянието между частиците и размера на магнитозомите [40].

Разстоянията бяха изчислени от изображенията, показани на фигури 2a и 4b. Разстоянията на пролуките отляво надясно на фигура 2а са 107 ± 8 nm и 96 ± 8 nm (отклонението поради наклона на пробата е взето предвид). За фигура 4b разстоянията отляво надясно са 150 ± 7 nm, 46 ± 13 nm и 242 ± 17 nm. Изчисленията, базирани на прост точкови модел на намагнитване, бяха извършени с помощта на верижната настройка, показана на фигура 2а. Магнитният момент на верига от 15 магнитозоми в MV-1 клетка беше изчислен, че е 7.1 × 10 −16 Am 2 от измервания с електронна холография [7]. Въз основа на този резултат, средният магнитозомен магнитен момент се оценява на 4,5 × 10 −17 Am 2 за всяка от 4-те магнитозоми на фиг. 2. Полето при „магнитозома e“ във верига 2 от съседната 4-магнитозомна верига е приблизително 5,5 × 10 4 A/m в посока на експериментално определения момент. Без наличието на „магнитозома f“ полето при магнитозомата би било ∼4,4 × 10 3 A/m в обратна посока на момента. При липса на съответно ориентирана магнитозома, това поле трябва да е достатъчно силно, за да преориентира „магнитозома e“ според предишни проучвания върху магнитната хистерезис на магнитозомите [7].

Komeili и сътр. [21] и Scheffel et al. [20] показа, че в клетките от вида Magnetospirillum магнитозомите се локализират и сглобяват от нишковидния актиноподобен протеин MamK, който изглежда изгражда прокариотния цитоскелет, отговорен за стабилността на магнитозомната верига. Киселинен магнитозомен мембранен протеин очевидно е отговорен за закрепването на магнитозомата към MamK [20]. Освен това се смята, че магнитозомите се агрегират отчасти чрез магнитни взаимодействия [20]. Клетките на Magnetovibrio blakemorei съдържат ген mamK в своя геном, но не mamJ. Това може да предположи, че механизмът за образуване на магнитозомна верига е малко по-различен при Magnetovibrio blakemorei от този при видовете Magnetospirillum и може да е причина за наличието на пропуски между магнитозомите в MV-1.

Честотата на клетките с магнитозомни подвериги с противоположна магнитна ориентация е ниска. Нашият статистически анализ показва 4,0% от всички клетки и 9,9% от тези клетки, които съдържат празнина. Тъй като обаче експериментът XMCD дава магнитна информация само за хоризонтално ориентирани вериги (интензитетът на XMCD спада с косинуса на отклонението от хоризонталата), нашата честота най-вероятно е подценяване. Ние изчисляваме, че XMCD сигналът може да се наблюдава само ако веригата е хоризонтална в рамките на ± 20 ° поради това затихване и статистическите граници на нашите измервания. Като се вземе предвид този фактор, очакваната честота на това явление за MV-1 ще се увеличи от 4,0 ± 0,2% до 18,0 ± 0,9%, когато се вземе предвид цялата популация на MV-1 и от 9,9 ± 0,4% до 44,6 ± 1,8% за MV -1 клетки с магнитозомни вериги, съдържащи пропуски. И накрая, не е известно дали клетките MV-1 в природата имат пропуски между магнитозомите и/или магнитозомните вериги и по този начин дали имат вериги с противоположни магнитни ориентации. Това е важно, защото понастоящем не можем да изключим възможността пропуските да са артефакт поради условия на растеж и/или темп на растеж. Необходими са повече експерименти с растеж, заедно с наблюдения върху некултивирани, диви проби, за да се изследва тази възможност.

Заключения

Ние показахме, че някои клетки на Magnetovibrio blakemorei, които съдържат магнитозомни подвериги, разделени от пространствени пролуки, показват аномални магнитни ориентации. Доказано е, че честотата на това е най-малко 4,0% от всички клетки и 9,9% от тези клетки, които имат пропуски. Действителната честота е вероятно значително по-висока, като се има предвид естеството на нашите измервания. Всички наблюдавани случаи на обръщане на ориентация са свързани с празнина, което предполага, че аномалната ориентация на подверигите се дължи на недостатъчно магнитостатично взаимодействие между подверигите, разделени с пропуски.

Благодарности

Благодарим на няколко анонимни рецензенти за предоставянето на много полезни коментари и информация, особено по отношение на силите на магнетизиране, действащи върху развиващите се магнитотактични бактерии. Благодарим на д-р. Jian Wang и Chithra Karunakaran за тяхната експертна подкрепа в канадския източник на светлина (CLS) и д-р Tolek Tyliszczak за неговата експертна подкрепа за STXM инструментариума в Advanced Light Source (ALS) и CLS. Повечето от изследванията на XMCD бяха проведени в STXM на лъч 10ID1 в CLS. Примерът, показан на фиг. 4 беше измерено при STXM на лъч 11.0.2 при ALS.

Принос на автора

Замислил и проектирал експериментите: SSK APH DAB. Изпълнени експерименти: SSK APH. Анализирани данни: SSK. Допринесени реагенти/материали/инструменти за анализ: DAB APH. Написа хартията: SSK DAB APH.