Фракции на мезенхимални стволови/стромални клетки (MSC-CM), добавени едновременно с трансформиращ растежен фактор-бета (TGFbeta), предотвратяват TGFbeta-индуцираното увеличаване на експресията на aSMA във фибробластите. Анализ на експресията на aSMA в култивирани контролни фибробласти без серум (- TGFbeta), във фибробласти след излагане на TGFbeta (+ TGFbeta) и TGFbeta с компонентите на MSC-CM (+ TGFbeta + MSC-EV; + TGFbeta + MSC-SF) . (A) RT-PCR (n = 9). (Б) Уестърн блотинг (n = 3).

мезенхимални

MSC-CM фракции, добавени едновременно с TGFbeta, предотвратяват индуцираното от TGFbeta преразпределение на aSMA в стрес влакна във фибробластите. Имунофлуоресцентен анализ (aSMA (зелен), фалоидин (червен), DAPI (син)) на съдържанието на aSMA в безсерумни култивирани контролни фибробласти (- TGFbeta), във фибробласти след излагане на TGFbeta (+ TGFbeta) и TGFbeta с компонентите на MSC-CM (+ TGFbeta + MSC-EV; + TGFbeta + MSC-SF). Скала: 100 μm.

MSC-CM фракции, добавени едновременно с TGFbeta, предотвратяват индуцираното от TGFbeta вътреклетъчно преразпределение на винкулин от перинуклеарната зона до местата за контакт на фокалната адхезия във фибробластите. Имунофлуоресцентен анализ (винкулин (зелен), фалоидин (червен), DAPI (син)) на съдържанието на винкулин в безсерумни култивирани контролни фибробласти (- TGFbeta), във фибробласти след излагане на TGFbeta (+ TGFbeta) и TGFbeta с компонентите на MSC-CM (+ TGFbeta + MSC-EV; + TGFbeta + MSC-SF). Скала: 100 μm.

MSC-CM фракции, добавени едновременно с TGFbeta, предотвратяват TGFbeta-индуцираното увеличаване на производството на колаген тип I и контрактилната активност на третираните фибробласти. Промени във функционалната активност на култивирани контролни фибробласти без серум (- TGFbeta), фибробласти след излагане на TGFbeta (+ TGFbeta) и TGFbeta с компонентите на MSC-CM (+ TGFbeta + MSC-EV; + TGFbeta + MSC-SF) . (A) RT-PCR върху колаген тип I (n = 9). (B) Анализ за свиване на колаген (n = 3) B.1 Графика. B.2 Макро снимки.

Фракциите на човешки дермални фибробласти (HDF-CM), добавени едновременно с TGFbeta, не са в състояние да предотвратят индуцираното от TGFbeta преразпределение на aSMA в стрес влакна и контрактилната активност на фибробластите. Експресията на aSMA в безсерумни култивирани контролни фибробласти (- TGFbeta), във фибробласти след излагане на TGFbeta (+ TGFbeta) и TGFbeta с компонентите на HDF-CM (+ TGFbeta + HDF-EV; + TGFbeta + HDF-SF ). (А) Имунофлуоресцентен анализ (aSMA (зелен), фалоидин (червен), DAPI (син)). Скала: 100 μm. (Б) Анализ за свиване на колаген.

MSC-CM фракции, добавени след третирането с TGFbeta, обърнаха TGFbeta-индуцираното увеличение на експресията на aSMA и нейното преразпределение в стрес влакна във фибробластите. Анализ на експресията на aSMA във фибробластите след излагане на TGFbeta (+ TGFbeta) и последващо заместване на растежната среда с компонентите на MSC-CM (+ TGFbeta -> MSC-EV; + TGFbeta -> MSC-SF) или контролен серум- безплатен DMEM (+ TGF b -> DMEM). (A) Имунофлуоресцентен анализ (aSMA (зелен), фалоидин (червен), DAPI (син)). Скала: 100 μm. (Б) Уестърн блотинг. * p DMEM група).

MSC-CM фракции, добавени след третирането с TGFbeta, обръщат стимулираната от TGFbeta контрактилна активност на фибробластите. Промени във функционалната активност на фибробластите след излагане на TGFbeta (+ TGFbeta) и последващо заместване на растежната среда с компонентите на MSC-CM (+ TGFbeta -> MSC-EV; + TGFbeta -> MSC-SF) или контролен серум -безплатен DMEM (+ TGFbeta -> DMEM). Анализ за свиване на колаген. * p DMEM група).

Характеризиране на извънклетъчните везикули (EVs), освободени от мезенхималната стромална клетка (MSC) след 48 часа кондициониране. (A, B) Разпределение на размера на частиците на EV препарати (червено) и контролни аликвотни части на MSC-CM след 30 минути кондициониране (сиво) за неконцентрирани (A) и 5-кратно концентрирани (B) проби, измерени чрез анализ на проследяване на наночастици (NTA). (C) MSC-EV изображения чрез трансмисионна електронна микроскопия (EVs са обозначени със стрелки).

Анализ на РНК профила в MSC-EV чрез RNA-sq. (А) Различни видове РНК са представени в MSC-EV. Клъстер от микроРНК, маркирани с червен овал. (Б) Променливост на представянето на микроРНК в донорната мастна тъкан MSC-EV по диаграми на Venn. (C) Най-разпространените микроРНК в MSC-EV (топ-10). (D) Представяне на микроРНК, свързано с фиброза в MSC-EV въз основа на техния предсказан анализ на генната цел.

Инхибирането на избрани микроРНК (miR-21 и miR-29c) от antagomiRs отслабва EV-медиираната способност на MSC да предотвратява индуцирана от TGFbeta диференциация на фибробласти в миофибробласти, оценена чрез производство на колаген тип I (A) и експресия на aSMA (B), Western blotting ( п = 3). EV: MSC-EV без трансфекция, IC: MSC-EV, трансфектиран чрез инхибиторен контролен олигос (контрол за анти-miRs). anti-miR-21: MSC-EV, трансфектиран от anti-miR-21, anti-miR-29: MSC-EV, трансфектиран от anti-miR-29 * p C) Общи цели на miR-21 и miR-29c, прогнозирани с помощта на MirNet обслужване. (D) Въздействие на miR-21, прехвърлено от MSC-EV, върху регулирането на избрани про-фиброзни цели във фибробласти, оценени чрез Western blotting (n = 1).

Резюме

1. Въведение

2. Материали и методи

2.1. Клетъчна култура

2.2. Кондиционирано средно събиране и фракциониране

2 × 10 3 клетки/cm 2). При 90–100% сливане клетките се промиват три пъти с буферен разтвор на Hanks (Paneco). След това съдовете се инкубират в продължение на 48 часа с 10 ml DMEM LG при 37 ° С, 5% СО2. DMEM LG без клетки се използва като отрицателна контрола (DMEM). След 48 часа средата се отстранява и се центрофугира за 10 минути при 300 х g, за да се отстранят клетъчните остатъци. MSC-CM се концентрира върху система за филтриране на тангенциален поток Minim ™ II, 10 kDa филтри (Pall Corporation, Порт Вашингтон, Ню Йорк, САЩ), след това се прехвърля в Amicon филтър (1000 kDa, Sigma, Милано, Италия) и се центрофугира за отделяне на извънклетъчните фракция на везикули (MSC-EV) от изчерпаната с EV фракция на MSC-CM (MSC-SF). И двете фракции се концентрират до 5 пъти. Всички проби се съхраняват при -80 ° C. Средният брой клетки след отстраняване на MSC-CM за концентрация е 6.8 × 105 клетки.