Резюме

Заден план:

Затлъстяването е свързано с повишен риск за здравето и е свързано с промени в бактериалната чревна микробиота, главно с намаляване на Бактероидети, но има малко данни на ниво род и вид. Съобщава се, че Лактобацилус и Bifidobacterium представители на рода могат да имат критична роля в регулирането на теглото като ефект срещу затлъстяването при експериментални модели и хора или като стимулиращ растежа ефект в земеделието в зависимост от щамовете.

Цели и методи:

За да потвърдите съобщените промени в червата и да проверите дали Лактобацилус или Bifidobacterium видове, открити в човешките черва, са свързани със затлъстяване или постно състояние, анализирахме изпражненията на 68 затлъстели и 47 контроли, насочени към Firmicutes, Bacteroidetes, Methanobrevibacter smithii, Lactococcus lactis, Bifidobacterium animalis и седем вида Лактобацилус чрез количествена PCR (qPCR) и култура върху Лактобацилус-селективна среда.

Констатации:

В qPCR, B. animalis (коефициент на коефициента (OR) = 0,63; 95% доверителен интервал (CI) 0,39–1,01; P= 0,056) и М. смити (ИЛИ = 0,76; 95% CI 0,59–0,97; P= 0,03) са свързани с нормално тегло, докато Lactobacillus reuteri (ИЛИ = 1,79; 95% CI 1,03–3,10; P= 0,04) е свързано със затлъстяване.

Заключение:

Чревната микробиота, свързана с човешкото затлъстяване, е изчерпана М. смити. Някои Bifidobacterium или Лактобацилус видове са свързани с нормално тегло (B. animalis) докато други (L. reuteri) са били свързани със затлъстяването. Следователно, съставът на чревната микробиота на видово ниво е свързан с телесното тегло и затлъстяването, което може да е от значение за по-нататъшни проучвания и управление на затлъстяването. Тези резултати трябва да се разглеждат внимателно, тъй като това е първото проучване до момента, което свързва конкретни видове Лактобацилус със затлъстяване при хората.

Въведение

Затлъстяването, дефинирано като индекс на телесна маса (ИТМ) над 30 kg m -2 (реф. 1) и масивно разширяване на мазнините, е свързано със значително повишена смъртност и е рисков фактор за много заболявания, включително захарен диабет, хипертония, дихателни нарушения, исхемична болест на сърцето, инсулт и рак. 2, 3 Затлъстяването може да се разглежда като трансмисивна болест, тъй като майчиното затлъстяване предразполага децата към затлъстяване в зряла възраст. 4 Разпространението му нараства непрекъснато сред възрастни, юноши и деца и се е удвоило от 1960 г. насам; и затлъстяването сега се счита за световна епидемия, тъй като например над 30% от населението на Северна Америка е със затлъстяване. Данните на СЗО показват, че в момента затлъстяването засяга поне 400 милиона души по света и 1,6 милиарда са с наднормено тегло. Освен това СЗО прогнозира, че до 2015 г. 2,3 милиарда възрастни ще бъдат с наднормено тегло и повече от 700 милиона ще бъдат със затлъстяване. 5 Причините за епидемията от затлъстяване изглеждат сложни и включват екологичен, генетичен, нервен и ендокринен произход. 6

Съвсем наскоро затлъстяването се свързва със специфичен профил на бактериалната чревна микробиота, включително намаляване на Bacteroidetes/Firmicutes съотношение 7, 8, 9, 10 и намаляване на Methanobrevibacter smithii, водещият представител на чревната микробиота архея. 11 След тези новаторски проучвания бяха открити значителни връзки между увеличаването на някои бактериални групи и затлъстяването (Лактобацилус, 12 Стафилококус ауреус, 13, 14, 15 Ешерихия коли, 15 Faecalibacterium prausnitzii 16). И обратно, други групи са свързани със слаб статус, главно принадлежащи към Bifidobacterium род. 11, 13, 14, 15, 16 Към днешна дата противоречивите проучвания показват ясно, че връзката между микробиома и наднорменото тегло е сложна. 17

Колкото пробиотични щамове на Лактобацилус и Bifidobacterium се предлагат на пазара в продукти за консумация от човека, променящи чревната флора 18 и стимулиращи местни щамове лактобацили и бифидобактерии 19, ние предположихме, че широкото поглъщане на пробиотици може да насърчи затлъстяването чрез промяна на чревната флора. 20, 21, 22 Това обаче остава противоречиво. 23, 24 В първата стъпка за изясняване на взаимодействията между пробиотиците за консумация от човека и затлъстяването, само няколко проучвания сравняват затлъстелите и слабите лица, като се фокусират върху Лактобацилус и Bifidobacterium родове на видово ниво 13, 16 и те не са успели да демонстрират значителни разлики, вероятно поради твърде малък размер на извадката. В резултат на това, чрез увеличаване на размера на пробата, ние анализираме състава на храносмилателната микробиота за Фиксира, Бактероидети, археите М. смити, Лактобацилус род, L. lactis, и да проучи връзките между седем избрани вида на Лактобацилус и един вид Bifidobacterium, използвани другаде в предлаганите на пазара пробиотици за консумация от човека и затлъстяване.

Материали и методи

Етика, участници и мостри

Анализ на чревната микробиота

Култура по конкретни Лактобацилус среден (LAMVAB среден)

След размразяване при стайна температура, 100 mg изпражнения се суспендират в 900 μl цистеин-пептон-воден разтвор 26 и се хомогенизират. Проведено е серийно разреждане във фосфатно буфериран физиологичен разтвор. Проби, разредени до 1/10 и 1/1000, се инокулират, като се използва 10 μl инокулационен контур върху LAMVAB среда. 27 След 72-часова инкубация в буркани (AnaeroPack, Mitsubishi Gas Chemical America, Inc., Ню Йорк, Ню Йорк, САЩ) в анаеробна атмосфера (GasPak EZ Anaerobe, Becton Dickinson, Хайделберг, Германия) при 37 ° C, номерът на морфотипове бяха идентифицирани и 1–4 колонии на морфотип бяха поставени на четири петна от MTP 384 Мишена плоча, изработена от полирана стомана (Bruker Daltonics GmbH, Бремен, Германия) и съхранявана в триптиказни кутии в соева културална среда (AES, Bruz, Франция ).

Лактобацилус събиране на щамове и база данни за спектри MALDI-TOF

The Лактобацилус събирането на щамове в нашата лаборатория е завършено от щамовете от колекциите Pasteur и DSMZ, а референтните спектри са създадени от липсващите в базата данни Bruker. Идентификацията на бактериите е извършена с масспектрометър Autoflex II (Bruker Daltonik GmbH). Данните бяха автоматично получени с помощта на Flex control 3.0 и Maldi Biotyper Automation Control 2.0. (Bruker Daltonics GmbH). Суровите спектри, получени за всеки изолат, бяха анализирани чрез стандартно съвпадение на моделите (със зададени параметри по подразбиране) спрямо спектрите на видовете, използвани като референтна база данни. Изолатът се счита за правилно идентифициран на видово ниво, когато поне един спектър има оценка ⩾ 1,9, а един спектър има оценка ⩾ 1,7. 28 Възпроизводимостта на метода е оценена чрез дублиращ анализ на 10 проби.

Количествена PCR в реално време за М. смити, Бактероидети, Фиксира и Лактобацилус род

ДНК се изолира от изпражненията, както е описано в Dridi и др. 29 Пречистените ДНК проби се елуират до краен обем от 100 μl и се съхраняват при -80 ° C до анализ. PCR в реално време се извършва на система Stratagene MX3000 (Agilent, Санта Клара, Калифорния, САЩ), използвайки QuantiTect PCR микс (Qiagen, Courtaboeuf, Франция), както е описано по-горе. 12

Количествена PCR в реално време, специфична за Lactococcus lactis, Bifidobacterium animalis и седем Лактобацилус видове

Статистически анализ

Първо, резултатите от Лактобацилус-специфичната култура и количествената PCR (qPCR) бяха сравнени в двете групи (затлъстели и контролна група), използвайки точния тест на Fisher при сравняване на пропорциите, и теста на Mann-Whitney при сравняване на бактериалните концентрации. Разликата се счита за статистически значима, когато P 30 Вторичен анализ, базиран на логистичен регресионен анализ, беше използван за идентифициране на променливите на културата (Лактобацилус концентрация на видове), когато е свързано със затлъстяване. Анализите на данни бяха проведени с помощта на SPSS v.9.0 (SPSS Inc., Чикаго, IL, САЩ).

Резултати

Пациенти

Общо бяха включени 115 субекта (68 пациенти със затлъстяване и 47 контроли). Тринадесет пациенти със затлъстяване и девет контроли бяха част от предишното проучване, проведено в нашата лаборатория. 12 Двете популации бяха еднородни по пол и височина, но не и по възраст (Таблица 1).

Култура

свързана

Количествено определяне на L. paracasei, L. plantarum и L. reuteri в култура (среда LAMVAB) - дневник (единици, образуващи колонии на ml изпражнения) - тест на Ман - Уитни.

Фиксира, Бактероидети, М. смити и Лактобацилус специфични за видовете qPCR

М. смити е установено по-често в контролите (40/45 (89%) срещу 50/67 (75%), точен тест на Fisher, P= 0,05). Анализът установи по-ниска концентрация на М. смити при затлъстели субекти (тест на Ман – Уитни, P= 0,002; Таблица 3) и по-висока концентрация на Лактобацилус (Тест на Ман – Уитни, P= 0,04). Бактероидети е установено при по-ниска концентрация при затлъстяване, но този резултат не е значителен (тест на Ман – Уитни, P= 0,25) (Фигура 2). Същите резултати бяха открити след изключването на общите субекти от предишното ни проучване (тест на Ман-Уитни; по-високо ниво на Лактобацилус род при затлъстели хора, P= 0,026; по-ниско ниво на М. смити, P= 0,008 и по-ниско ниво на Бактероидети, P= 0,09).

Количествено определяне на Bacteroidetes, Firmicutes, M. smithii и Лактобацилус род чрез qPCR — тест на Ман – Уитни.

Bifidobacterium-Лактококи-Лактобацилус специфични за видовете qPCR

Количествено определяне на B. animalis, L. casei/paracasei, L. plantarum и L. reuteri чрез qPCR — тест на Ман – Уитни.

Логистичен регресионен анализ

Резултатите от логистичния регресионен анализ на резултатите от qPCR са представени в Таблица 5. Променливите, допустими за крайния модел, бяха L. casei/paracasei, L. reuteri, L. gasseri, B. animalis, M. smithii и възраст. Окончателният модел на множествена логистична регресия показа, че след корекция за възрастта, L. reuteri, B. animalis и М. смити са били значително свързани със затлъстяването. L. reuteri беше единственият, който показа по-високи нива при затлъстели индивиди, докато B. animalis и М. смити са открити на по-високи нива при лица със затлъстяване.

Дискусия

Доколкото ни е известно, ние докладваме най-голямото проучване за контрол на случаите, сравняващо човешката затлъстела чревна микробиота с контролите, фокусирани върху Archaea, Bacteroidetes, Firmicutes, Lactobacillus род, Lactococcus lactis и B. animalis и за първи път използвахме зависим от културата и независим от културата метод за сравнение на Лактобацилус популация на видово ниво между затлъстели и нормално претеглени хора. Нашите резултати потвърждават глобалната промяна в затлъстелите чревни микробиоти с по-ниско ниво на М. смити както вече се съобщава в литературата, 11 и наскоро докладват по-ниски нива на B. animalis, L. paracasei, L. plantarum и по-високи нива на L. reuteri при затлъстяла чревна микробиота.

Намаляването на Бактероидети беше исторически първата промяна, свързана значително със затлъстяването, както се съобщава от Ley и Turnbaugh, 8 при мишки и при лица от Северна Америка, 7, 9 и от Santacruz и др., 15, които са наблюдавали бременни жени с наднормено тегло в Испания. Открихме същата корелация в предишното ни проучване, 12 и същата посока на ефекта в настоящото проучване със същата PCR система върху цялата популация и след изключването на често срещаните субекти. Швиерц и др. 11 отчитат противоположни резултати, но методологията е нежелана, тъй като Бактероидети пропорция се получава чрез сумиране Бактероиди и Превотела родове. Други проучвания не установяват взаимодействие между относителното или абсолютното изобилие на Бактероидети и затлъстяване. 31, 32, 33

В предишното ни проучване, 12 изобилие от М. смити е значително по-висок при пациенти с анорексия, но не и при слаби контроли. В това ново проучване открихме това М. смити е по-рядко и значително по-рядко при пациенти със затлъстяване от цялата популация и след изключването на често срещаните субекти. Швиерц и др. 11, използвайки специфичен qPCR за Метанобревибактер видове, открили подобни резултати в германска популация. Тези резултати са в противоречие с тези на Zhang и др. 33, които откриха това Метанобактерии присъства само при затлъстели индивиди, използващи qPCR, но са сравнени само три затлъстели срещу три контроли.

L. plantarum и L. paracasei са свързани с нормално тегло в културата, в съответствие с експерименталните модели в литературата, отчитащи ефект срещу затлъстяването на L. plantarum при мишки. 37 Други Лактобацилус щамове са показали ефект срещу затлъстяването при животни и хора, подобен на L. gasseri SBT2055 (LG2055) щам при слаби плъхове Zucker 38 и при хора. 39 Този ефект срещу затлъстяването може да бъде свързан с производството на специфични молекули, които могат да повлияят на метаболизма на гостоприемника, като конюгирана линолова киселина (CLA) за L. plantarum или L. rhamnosus. 37, 40 In vivo и инвитро анализи на физиологични модификации, придавани от CLA върху протеиновата и генната експресия, показват, че CLA упражнява своите делипидиращи ефекти чрез модулиране на енергийните разходи, апоптоза, окисление на мастни киселини, липолиза, диференциация на стромални съдови клетки и липогенеза. 37 Автори, които са изследвали механизмите, свързващи конюгираната линолова киселина и ефектите срещу затлъстяването, съобщават за регулирана експресия на гени, кодиращи разединяващи протеини (UCP-2), което може да бъде основен механизъм, чрез който CLA увеличава енергийните разходи и произвежда анти-затлъстяване ефект. 40

L. reuteri се свързва тук със затлъстяването. L. reuteri е един от най-изследваните пробиотични видове, особено заради способността му да инхибира растежа на други потенциално патогенни микроорганизми чрез секреция на антибиотични вещества като реутерин. 41 Когато се въвежда при свине, пуйки и плъхове, L. reuteri доведе до значително наддаване на тегло и беше изолиран в по-високи концентрации от изпражненията след приложение на пробиотик. 42, 43, 44 Механизмът, чрез който L. reuteri е в състояние да подкрепи здравословния растеж на тези животни не е напълно изяснено. Възможно е това L. reuteri просто служи за защита на добитъка срещу болести, причинени от Salmonella typhimurium и други патогени. Други проучвания обаче разкриват това L. reuteri може да помогне и когато депресията на растежа е причинена изцяло от липса на хранителни протеини, а не от заразна болест. 45 Това поражда възможността, че L. reuteri подобрява по някакъв начин способността на червата да усвояват и преработват хранителни вещества и увеличава конверсията на храната. 46

И накрая, специфични щамове на Лактобацилус и Bifidobacterium Доказано е, че хранените на селскостопански животни ежедневно увеличават наддаването на тегло 55 и този факт се използва от десетилетия в селското стопанство за увеличаване на конверсията на фуражите. В този контекст не може да се изключи, че ефектът на „стимулиране на растежа“ при животни, свързан с орално приложение на специфични щамове пробиотици, е подобен на механизмите, свързани с човешкото затлъстяване. Например Абдулрахим и др. 56 съобщиха за това L. acidophilus значително повишено отлагане на мазнини в корема при женски пилета, когато се прилага самостоятелно и до 31%, когато е свързано с цинков бацитрацин. Следователно по-нататъшните проучвания са задължителни за изследване на взаимодействията между пробиотиците и регулирането на теглото.

Заключение

В заключение, намалени нива на М. смити е потвърдено, че е свързано със затлъстяване. В допълнение, по-високи нива на B. animalis, L. paracasei или L. plantarum са свързани с нормално тегло, докато по-високи нива на L. reuteri са свързани със затлъстяването, което предполага възможна взаимовръзка между определени пробиотични видове, продавани другаде за консумация от човека, и затлъстяването. Тези резултати трябва да се разглеждат внимателно, тъй като това е първото проучване до момента, което свързва конкретни видове Лактобацилус със затлъстяване при хората. Този въпрос ще бъде от решаващо значение за управлението на епидемията от двадесет и първи век, която е затлъстяване, и особено предвид процъфтяващия пазар на пробиотици.