Резюме

Приготвяне на митохондриални фракции.

Дейност на електронната транспортна верига.

Електронната транспортна верига е показана на фиг. 1. Активността на сукцинат оксидазата (сукцинат: O2 оксидоредуктаза) се измерва в реакция, започваща от сукцинат дехидрогеназа и се основава на анализ на натрупването на фумарат, краен продукт на сукцинат окисление. Тази процедура е модификация на предварително разработен анализ (24). Накратко, анализът свързва фумаразни и ябълчно-дехидрогеназни реакции, за да окисли фумарат и да намали NAD, с високоефективна течна хроматография и флуоресценция, използвани за измерване на NADH (18). Сукцинат дехидрогеназата се активира предварително, както е описано по-горе, за да се премахне инхибирането чрез плътно свързан оксалацетат (23). Активността на CK се измерва като индекс на съдържанието на мускулни влакна в биопсични проби, както беше описано по-рано (12,18), и активността на електронната транспортна верига беше изразена нормализирана към CK активност. Активността на CK се измерва при 30 ° C чрез проследяване на генерирането на NADPH в свързана ензимна реакция (хексокиназа/глюкоза-6P дехидрогеназа) (25).

диабет

определяне на mtDNA.

Съдържанието на mtDNA беше измерено с помощта на PCR в реално време, както е описано по-рано (26). Откриване на 69-bp фрагмент от mtDNA (нуклеотиди 14918–14986) и 77-bp фрагмент от β-глобин, и двата въз основа на маркери, публикувани от Miller et al. (27), бяха използвани за определяне на относителния брой копия на mtDNA на диплоиден ядрен геном. Грундове и маркирани с FAM сонди Taqman TAMRA (№ 450025; Applied Biosystems, Foster City, CA) са проектирани с помощта на софтуера Primer Express, версия 1.5 (Applied Biosystems) и са изброени в Таблица 1. ДНК (митохондриална и ядрена) е извлечена от тъканни проби, използвайки QIAamp ДНК мини-комплект (Qiagen, Chatworth, CA). Концентрацията на всяка проба се определя с помощта на спектрофотометър GeneQuant (Pharmacia Biotech).

PCR условия.

Откриването на mtDNA и β-глобин се извършва като две отделни реакции, но в рамките на един и същ цикъл за всяка проба. Всички проби бяха пуснати в два екземпляра за всеки ген. Реакциите бяха проведени в присъствието на 1 × Taqman Universal PCR Master Mix (4304437; Applied Biosystems), 1 μmol/l всеки напред и обратно праймер, 0,25 μmol/l маркирана с FAM сонда Taqman/TAMRA и 20 ng проба ДНК към краен обем от 25 μl. Реакциите на усилване бяха проведени в спектрофлуорометричен термоциклер Prism 7700 (Applied Biosystems) при следните условия на цикъла: 50 ° C за 2 минути инкубация на урацил-ДНК N-гликозилаза, 95 ° C денатурация и стъпка на активиране на ензима за 10 минути, последвани от 40 цикъла от 95 ° C денатурация за 15 s и 60 ° C отгряване и удължаване за 60 s. Флуоресцентните спектри бяха записани по време на фазата на отгряване на всеки PCR цикъл. За генериране на FAM флуоресценция е използван софтуер за система за откриване на последователности (версия 1.7) за Prism 7700.

Изчисления на праговия цикъл.

Номерът на праговия цикъл е изчислен с помощта на софтуера SDS версия 1.7 (Applied Biosystems) и автоматично задаване на базовата линия. Базовата стойност е средната флуоресценция на PCR цикли 3–15 плюс 10 пъти стандартното отклонение. Тези стойности бяха използвани за изчисляване на относителни изчисления на броя на копията чрез изразяване на разликите в броя на праговия цикъл на β-глобина и mtDNA PCR, както е описано по-рано (26): Rc = 2 ΔCt и ΔCt = Ctβ-глобин -CtmtDNA, където Ct е номерът на праговия цикъл и Rc е относителният номер на копие.

Трансмисионна електронна микроскопия.

За допълване на оценката на митохондриалните разпределения, базирани на методите на субклетъчно разделяне, както е описано по-горе, беше използван ТЕМ за изследване на дебелината на слоя на подсарколемалните митохондрии, използвайки преди това публикуван метод (28). Мускулните проби, използвани за ТЕМ, бяха нарязани на малки парченца (1 × 1 × 2 mm), фиксирани в 2,5% глутаралдехид, постфиксирани в 1% осмиев тетроксид, дехидратирани и вградени в Epon при надлъжна или напречна ориентация. След първоначално скрининг на полумощни секции (300 nm), оцветени с толуидиново синьо, за да се оптимизира равнината на секциониране (29), се изрязват ултратънки (60 nm) надлъжни секции и се монтират върху медни решетки и се оцветяват с оловен цитрат (30) и уранилацетат (31). Профилите бяха изследвани с помощта на TEM (JEOL 100CXII) при ускоряващо напрежение 80 kV. Дебелината (μm) на подсарколемалните митохондрии в надлъжните ориентации беше измерена с помощта на система за анализ на изображения (Национален институт по здравеопазване изображение 1.61).

Статистика.

Данните са представени като средните стойности ± SE, освен ако не е посочено друго. ANOVA се използва за сравняване на групи и субфракции на митохондриите, а ANCOVA се извършва за адаптиране към въздействието на възрастта и пола. Използвана е линейна регресия и поетапна множествена регресия, за да се изследват връзките между активността на мускулната електронна транспортна верига и инсулиновата чувствителност.

РЕЗУЛТАТИ

Изследвайте доброволци.

Клиничните характеристики на доброволците в изследвания са показани в Таблица 2. Групите със затлъстели недиабетни и затлъстели диабет тип 2 са съпоставени по възраст и ИТМ. Инсулиновата чувствителност има тенденция да бъде по-ниска при тези с диабет тип 2, но не се различава съществено от контролните субекти със затлъстяване (P = 0,17). Плазмената глюкоза на гладно и HbA1c са по-високи при диабет тип 2, отколкото при субекти със затлъстяване.

Клетъчно разпределение на митохондриите.

Електронната транспортна верига на митохондриите е изобразена в тази схема, показваща четирите дихателни комплекса, състоящи се от NADH-дехидрогеназа (NADH-DH), сукцинат дехидрогеназа (SDH), цитохром bc1 (bc1) и цитохром оксидаза (COX) и ATP синтаза (Комплекс V), която свързва мембранния потенциал с фосфорилирането на ADP.

Показана е представителна трансмисионна електронна микроскопия на надлъжни участъци на човешки скелетни мускули от постно (T) и доброволец за изследване на диабет тип 2 (DM) (bar = 2,5 μm). Дебелината на перинуклеарното разпределение на подсарколемалните митохондрии е измерена с помощта на анализ на изображението (Национален институт по здравеопазване изображение 1.61) и може да се наблюдава, че е значително изчерпана при диабет тип 2.

Поредици от амплификационни грундове и сонди

Клинична характеристика на доброволците, изследващи

Активност на електронната транспортна верига в субсарколемални и интермиофибриларни фракции на митохондриите на човешки скелетни мускули

Съдържание на митохондриална ДНК в скелетните мускули при слаби, затлъстели и доброволци за изследване на диабет тип 2

Благодарности

Това разследване беше подкрепено с финансиране от Националния институт по диабет и храносмилателни и бъбречни заболявания, Национални здравни институти (DK49200); Университетският център за клинични изследвания в Питсбърг (5 M01RR00056); и Изследователския център за затлъстяване и хранене (P30DK462).

Благодарим за ценния принос на Карол Кели, BSN, RN, координатор на изследванията и медицинския персонал на Общия клиничен изследователски център на Университета в Питсбърг. Изразяваме признателност и към участниците в изследването.