РЕЗЮМЕ

ВЪВЕДЕНИЕ

Измерването на естествено срещащите се въглеродни и азотни стабилни изотопи в животинските тъкани е мощен инструмент в изследването на диетичната екология. Изотопният състав на животно отразява изотопния състав на диетата му по предсказуем начин (DeNiro and Epstein, 1978; DeNiro and Epstein, 1981). След промяна на диетата обаче изотопният състав на тъканите на животното не се променя незабавно [Cerling et al. (Cerling et al., 2007) и препратки към тях]. Различните тъкани включват изотопния състав на диетата с различна скорост (Tieszen et al., 1983). Разликите в изотопната инкорпорация между тъканите могат да бъдат полезни, тъй като тъканите с бързи инкорпориращи нива разкриват краткосрочни промени в диетата, докато тъканите с бавна инкорпорация интегрират изотопния състав на диетата през по-дълги интервали (Pearson et al., 2003; Podlesak et ал., 2005).

диетичният

Идеята за връзката между скоростта на метаболизма и скоростта на включване на изотопни C и N е разширена от Carleton и Martínez del Rio (Carleton and Martínez del Rio, 2005), които интерпретират „високата метаболитна активност“ като висока степен на протеинов синтез и катаболизъм. Те тестваха хипотезата, че хроничното излагане на студ, а оттам и увеличаването на скоростта на метаболизма, би увеличило степента на изотопно включване от 13 С и 15 N в червените кръвни клетки на домашното врабче (Passer domesticus). Те откриха, че въпреки повишената скорост на метаболизма, излагането на студ няма ефект върху скоростта на включване 15 N и има само малък ефект върху скоростта на включване 13 C. Те стигнаха до заключението, че връзката между скоростта на метаболизма и скоростта на включване на изотопи в тъканта на животното е непряка и вероятно медиирана от скоростта на белтъчния оборот. Известно е, че хранителните протеини имат регулаторен ефект върху протеиновия синтез и разграждане (Millward, 1989; Lobley, 2003). Физиолозите са документирали увеличаване на протеиновия синтез в резултат на повишен прием на протеин в риби (Millward, 1989; Houlihan et al., 1995), домашни пилета (Dror et al., 1997) и бозайници (Yahya et al., 1994; Wessels et al ., 1997; Williams et al., 2001), включително хора (Foulliet et al., 2001). Следователно, ние трябва да очакваме да намерим корелация между приема на протеини и N фракционен изотопен процент на оборот.

Проведохме експеримент за хранене на затворена жълтовентилирана булбула (Pycnonotus xanthopygos), плодородна птица от Стария свят, за да тестваме предположенията, че хранителният протеин влияе върху скоростта на включване на изотопи. Птиците получават диети, които имат сходни калорични стойности и подобни δ 15 N изотопни сигнатури, но варират в съдържанието на протеини. Следователно бихме могли да изолираме ефекта на хранителните елементарни концентрации върху фракционната скорост на N изотопен обмен в тъканите. Целите на експеримента бяха да се определи ефектът от приема на протеини върху: (1) скоростта на фракционен обмен на азот на червените кръвни клетки и плазмата и (2) δ 15 N фактори за дискриминация на тъкан и диета на кръвните клетки, плазмата, екскретите и уретерите урина. Ние предположихме, че скоростта на N фракционен изотопен оборот и δ 15 N фактори за дискриминация между тъканите и диетата ще се увеличат с увеличаване на приема на протеини. Изчерпването на 15 N в азотирани екскретирани продукти често е посочвано като причина за обогатяването на тъканите към диетата в 15 N (Minagawa and Wada, 1984; Martínez del Rio and Wolf, 2005). По този начин ние също предположихме, че както уретера, така и екскретите ще бъдат изчерпани с 15 N спрямо диетата.

Данните за включване на изотопи обикновено се анализират с помощта на прости модели с едно отделение, с кинетика от първи ред (Carleton and Martínez del Rio, 2005; Mirón et al., 2006; Cerling et al., 2007). Cerling и сътр. (Cerling et al., 2007) оспори използването на тези модели и отстоява използването на по-сложни модели с много отделения. Използвахме нашите методи за сравнение на теоретични модели на данни и информация, за да оценим Cerling и колегите “(Cerling et al., 2007) (Stephens et al., 2007). Използвахме информационните теоретични критерии на Akaike, за да оценим дали доказателствата подкрепят използването на модели с едно отделение или с две отделения.

МАТЕРИАЛИ И МЕТОДИ

Улавяне, грижи и поддръжка на птици

Експериментален състав на диетата

Експеримент за смяна на диетата

Всички проби се смилат на фин прах, преди да бъдат заредени (30–70 μ g) в калаени капсули. Изотопните съотношения на храната се измерват в масов спектрометър с непрекъснат поток изотопно съотношение (Finnigan Delta + XP, Университетът на Уайоминг, Устойчив на изотопно съоръжение) с проби, изгаряни в елементален анализатор на Costech. Прецизността на тези анализи е ± 0,2 ‰ за двата изотопа. Нашите стандарти бяха пептон (δ 15 N = 5.60 ‰, AIR, USGS40 8542) и глицин (δ 15 N = 0.73 ‰, AIR, IAEAN2). Включихме стандарти във всеки цикъл, за да коригираме суровите стойности, получени от масспектрометъра. Стабилните изотопни съотношения бяха изразени, като се използва стандартна делта нотация (δ 15 N) в части на милион (‰) като: където Rsample и Rstandard са 15 N/14 N съотношения на пробата, съответно. Пробите са посочени спрямо атмосферния азот (AIR). Таблица 2 изброява изотопния състав на съставките на нашата диета.

Елементарен и изотопен състав на съставките на експерименталните диети

статистически анализи

Графиките на променливата прогресия на реакцията всички показват тенденции на намаляване между ln (1 – F) и времето. Трудно е обаче да се различи от тези графики дали за всеки набор от данни трябва да се прилага модел с едно или две отделения. Различни символи във всеки етикет на панела за всеки отделен човек. За всички фигури вижте Списък на съкращенията и символите за дефиниции.

Кинетични модели от първи отдел с първостепенни модели на изотопни модели на включване адекватно описват включването на 15 N в кръвните клетки и плазмата на жълтовентилираните булбули. Точките са средни стойности, а лентите са s.e.m. Кривите бяха монтирани, използвайки средни стойности от δ 15 N (∞), [δ 15 N (∞) –δ 15 N (0)] и τ. Стойностите за тези параметри са показани в уравненията. Както уравненията, така и монтираните криви са представени само с описателна цел. Всички статистически анализи бяха проведени върху данни за индивиди.

РЕЗУЛТАТИ

Графиките на променливия ход на реакцията са показани на фиг. 1 и показват, че са необходими най-много две отделения за описване на данните. Методът обаче не позволява ясно определяне дали данните поддържат модел с едно или две отделения. Във всички случаи AICc поддържаше модела с два отделения. Стойностите на Δi варираха от 2,1 до 15,8, което предполага малко подкрепа за двукамерния модел. Следователно, използвахме τ, за да характеризираме времето на престой от 15 N в плазмата и кръвните клетки. Моделът с едно отделение е не само по-добър от модела с две отделения, но също така описва адекватно данните (r 2> 0,94; Фиг. 2).

Съдържанието на протеини в диетата имаше значителен ефект върху времето на престой от 15 N (F2,10 = 5,54 и F2,10 = 4,73, P 15 N времето на престой беше по-високо, когато птиците ядоха диетата с по-ниско съдържание на протеини. Диетичен протеин съдържанието също има значителен ефект върху Δ 15 N (F2,10 = 7,53 и F2,10 = 9,58, P 15 N не се различава между диетите с ниско и средно съдържание на протеин, но е значително по-ниско при диетата с най-високо съдържание на протеин (Фиг. 4). Кръвта, клетките и екскретите са обогатени с 15 N спрямо диетата (една проба t> 13, P 15 N спрямо диетата (диета с ниско съдържание на протеини, t = 2,8, P 0,5, съответно; Фиг. 5 ).

ДИСКУСИЯ

В жълтовентилираните булбули съдържанието на протеин оказва значително влияние както върху степента на включване (а оттам и върху времето на престой) от 15 N, така и върху изотопните фактори на дискриминация между тъканите и диетата. Нашите резултати също така показват, че за плазмата и клетките модели с едно отделение са по-добре поддържани от по-сложните модели с две отделения. Тук първо обсъждаме предимствата на използването на подходи за сравнение на модели пред графичния подход за променлива реакция, предложен от Cerling et al. (Cerling et al., 2007). След това разглеждаме възможните физиологични механизми, които водят както до по-голямо включване от 15 N, така и до по-ниско Δ 15 N при по-висок прием на протеин. И накрая, ние разглеждаме последиците от ефекта на приема на протеини върху изотопното включване за интерпретацията на екологичните изотопни данни.

Едно две. Колко отделения?

Изотопните еколози имат предвид три въпроса, когато провеждат експеримент за включване на изотопи. (1) Какво е средното време на престой на изотопа в тъкан? (2) Колко доверие можем да положим на тази оценка? (3) Кои са факторите, които влияят на неговата стойност? Биолозите провеждат проучвания за включване на изотопи на животни в плен, за да отговорят на тези три въпроса. По този начин централният параметър, който представлява интерес от експериментите за включване на изотопи, е средното време на задържане (τ), което може лесно да се трансформира в по-широко използвания полуживот t1/2 = τ [ln (2)] (Carleton and Martínez дел Рио, 2005)>. В нашето проучване средното време на задържане от 15 N в кръвните клетки е почти четири пъти по-дълго от това в плазмата. В жълтовентилираните булбули изотопният състав на плазмата е информативен за промените в диетата в рамките на по-малко от седмица, докато клетките разкриват модели на използване на ресурсите в мащаб от 20 дни до месец.

Съдържанието на протеини в храната оказва значително влияние върху средното време на престой от 15 N в плазмените разтворени вещества и кръвните клетки на жълтовентилираните булбули. Колоните означават средни стойности и ленти s.e.m. Средствата с една и съща буква във всеки панел не се различават статистически едно от друго. Начертахме данните за плазмата и клетките, използвайки една и съща скала, за да подчертаем голямата разлика в скоростта на включване и следователно времето на престой между тези две тъкани.

Доскоро повечето проучвания за включване на изотопи използваха модели с едно отделение от първи ред (уравнение 1) за описване на данните за включване на изотопи (Martínez del Rio и Wolf, 2005). Наскоро Cerling et al. (Cerling et al., 2007) поставят под въпрос общото използване на тези прости модели и предлагат използването на алтернативен графичен подход за диагностициране дали набор от данни разкрива дали са необходими модели с повече от едно отделение/пул, за да се опише набор от данни за изотопно включване . Този метод е потенциално важен, тъй като използването на грешен модел може да доведе до грешна оценка на средното време на пребиваване. Подходът на Cerling разчита на „линеаризиране“ на данните за вграждане на изотопи и използване на линейна регресия с най-малки квадрати върху получените линейни сегменти, за да се оцени относителният размер на всеки басейн/отделение и неговата константа на „разпад“/включване (Фиг. 1) (Ayliffe et al ., 2004).

Въпреки че необходимостта от използване на правилния модел за описване на данни за изотопно включване е неоспорима, методът, предложен от Cerling et al. (Cerling et al., 2007) има няколко недостатъка: (1) не позволява да се изчисли времето за задържане на изотопа (и мярка за това колко голяма увереност можем да му дадем); (2) трябва визуално да се идентифицира линейният сегмент за всеки компонент/пул; (3) разчита на данни за преобразуване на журнали, което често води до пристрастна оценка (Motulsky and Ransnas, 1987); и (4) няма количествен критерий, който позволява да се установи дали човек трябва да използва едно, две или повече отделения. Използването на нелинейни процедури за регресия, за да се съчетаят данните за включване в модели с нарастваща сложност, преодолява проблеми 2 и 3 (Bates and Watts, 1988). Тези модели са широко достъпни в повечето пакети за статистически анализ. За модели с едно отделение продукцията на тези програми включва различни оценки на стандартна грешка за τ, които след това могат да бъдат използвани за оценка на доверителен интервал (например Motulsky и Christopoulos, 2003). За по-сложни модели с много отделения, уравнение 3 може да се използва за оценка на средното време на задържане (C.M.d.R. и R. A. Sprecher, непубликувани наблюдения).

Диетичното съдържание на протеини оказва значително влияние върху фактора на дискриминация между тъканите и диетата при жълтовентилираните булбули. Колоните означават средни стойности и ленти s.e.m. Средствата с една и съща буква във всеки панел не се различават статистически едно от друго.

Δ 15 N на клетките, плазмата и екскретите е значително обогатен спрямо диетата при жълтовентилирани булбули при всички диети. За разлика от тях, δ 15 N урина е изчерпана спрямо диетата при птици, хранени с диета с ниско съдържание на протеин. Δ 15 N урина не се различава от тази на диетата при птици, хранени с диети със средно и високо съдържание на протеин. Лентите за грешки представляват 95% доверителни интервали за средства.

За преодоляване на проблем 4 използвахме информационно-теоретичния подход, застъпен от Бърнъм и Андерсън (Burnham and Anderson, 2002) и широко приет в екологичните изследвания (Hobbs and Hilborn, 2006). Този подход има силна теоретична основа и се основава на идеята, че трябва да възприемем икономични модели, които избягват недостатъчно и прекалено приспособяване и дават точни сближения на интерпретираната информация в наличните данни (Anderson and Burnham, 2001). Нашите данни подкрепят използването на едно отделение над модели с две отделения за плазма и кръвни клетки в жълтовентилирани булбули.

Как влияе приемът на протеин върху скоростта на изотопно включване?

При жълтовентилираните булбули приемът на протеин оказва значителен ефект както върху скоростта на включване на 15 N, така и върху Δ 15 Ntissue-диета. Птиците, които консумират повече протеини, имат значително по-високи нива на включване 15 N и по-ниски Δ 15 Ntissue-диета. Карлтън и Мартинес дел Рио (Carleton and Martínez del Rio, 2005) предположиха, че белтъчният оборот е основният фактор, определящ изотопното включване. Ако тази хипотеза е вярна, тогава същите фактори, които оказват влияние върху белтъчния оборот, трябва да повлияят на изотопното включване. Приемът на протеини влияе върху обмена на протеини чрез действието на катаболни (глюкагон, адреналин и кортизол) и анаболни хормони [инсулин, IGF и растежен хормон (прегледано от Waterlow, 2006)]. Изглежда, че секрецията на тези хормони се медиира от циркулиращите концентрации на аминокиселини, които от своя страна се влияят от състава на диетата (Waterlow, 2006). Разликите в скоростта на включване на 15 N сред диетите, наблюдавани при жълтовентилираните булбули, са в съответствие с идеята, че белтъчният обмен е определящ фактор за степента на включване на изотопите.

Muramatsu et al. (Muramatsu et al., 1987) съобщават за увеличаване на белтъчния оборот с прием на протеини при умерени нива на протеинов прием при пилетата. При тези животни ефектът от приема на протеини както върху синтеза, така и върху катаболизма е независим от приема на протеин при висок прием на протеин (Muramatsu et al., 1987). По същия начин, в кръвните клетки скоростта на изотопно включване (изчислена по 15 N време на задържане) се е увеличила от ниската до средната диета, но не се различава между диетите със средни и високи нива на протеин. Tsahar et al. (Tsahar et al., 2005) изчислява необходимостта от поддържащ азот (MNR) за жълтовентилирани булбули като ~ 8,2 mg N на ден. От измерванията на ежедневната консумация ние изчислихме, че дневният прием на азот на птици на диета с ниско съдържание на протеини е ~ 97 mg N на ден, което е повече от порядък по-високо от техния MNR. Очакваме ефектът от приема на протеин върху скоростта на включване на изотопи да бъде по-голям при по-ниски приема на азот, когато скоростите на прием на N се доближават до MNR.

Нашите резултати бяха в противоречие с предположението, широко използвано в литературата за стабилни изотопи: ако животните удовлетворяват изотопния баланс на масата, тогава Δ 15 Ntissue – диета може да бъде положителна само ако (1) δ 15 N на отделения азот е по-отрицателен от този на тъканите ( Minagawa и Wada, 1984; Ponsard и Averuch, 1999) и (2) в стабилно състояние, δ 15 N от екскретираните продукти се равнява на диетата (Martínez del Rio and Wolf, 2005). Въпреки че установихме, че δ 15 N на екскретирания азот е по-отрицателен от този на тъканите, във всички случаи δ 15 N на екскретирания азот е значително по-положителен от този на диетата (фиг. 5). Δ 15 N уретера урината, както се очакваше, или по-изчерпани 15 N от диета или има същите δ 15 N като диета. Как можем да обясним широко наблюдаваната положителна стойност на Δ 15 Ntisue-диета, ако отделеният азот има по-положителна стойност от диетата? И как можем да обясним разликата в δ 15 N между екскретите и уретера? Има две алтернативни/допълващи се обяснения: (1) изотопно лекият амоняк може да е загубен по време на събирането на проби от екскременти, но не и по време на събирането на уретера, и (2) птиците са загубили изотопно лек азот от уретера през неидентифицирано място.

Екологични последици

Скоростта, с която тъканта включва изотопния сигнал на диетата, определя времевия прозорец, през който еколозите могат да разпознаят промените в диетата (Pearson et al., 2003; Podlesak et al., 2005). Почти четирикратната разлика в изотопното включване между плазмата и кръвните клетки е полезна, тъй като позволява намирането на диети на две контрастни скали. Плазмата ще разкрие изотопния състав на храните, изядени през последните няколко дни, докато кръвните клетки ще отразяват средния състав на храни, включени в продължение на приблизително един месец (Hobson and Clark, 1992; Norris et al., 2004; Dalerum and Angerbjörn, 2005) . Кръвните клетки и плазмата са особено ценни тъкани при изотопни изследвания, тъй като вземането на проби от тях е минимално инвазивно (Norris et al., 2005).

СПИСЪК НА СЪКРАЩЕНИЯТА И СИМВОЛИТЕ

Информационните критерии на AICc Akaike, коригирани за малки проби BMR базална скорост на метаболизма (W) C въглерод F реакционен процес променлива k фракционна скорост на изотопно включване (ден –1) Mb средна телесна маса (g) MNR минимална потребност от азот (mg N ден –1) N азотно R съотношение на моларно изобилие от тежък към лек изотоп δ 15 N (Rsample/Rstandard – 1) × 1000, където Rsample и Rstandard са 15 N/14 N съотношения на пробата и еталона, съответно (‰) Δ 15 Ntissue –Диетична тъкан към диета дискриминационен фактор (‰) Δi разлика в AICc (Δi = AICci – AICcmin) τ оценка на средното време на задържане (дни)