РЕЗЮМЕ

ВЪВЕДЕНИЕ

Неутрофилите са първите имунни клетки, които пристигат на мястото на възпаление (11). Те имат способността да поглъщат голям брой бактерии, но също така могат да създадат увреждане на тъканите в гостоприемника, ако са твърде активни (12). Неутрофилите са важни за защита срещу инфекции със S. aureus. Те се привличат към местата на инфекция от възпалителни цитокини, като TNF-α, IL-1 и IL-6, както и от хемокини, свързващи се с хемокиновия рецептор CXCR2 (13).

киселини

Има няколко проучвания, които показват, че диетичният състав на мазнините оказва значително влияние върху биологичните функции и здравето. Промените в разпределението между наситени и ненаситени хранителни мастни киселини изглежда са особено важни за сърдечно-съдовите и метаболитните заболявания (14, 15). Диетичните мазнини също могат да бъдат от значение за имунната защита срещу инфекции. По-рано сме наблюдавали, че мишките, хранени с наситена диета с високо съдържание на мазнини (HFD-S), са намалели оцеляването, когато са подложени на септична инфекция на S. aureus в сравнение с мишки, хранени с диета с ниско съдържание на мазнини (LFD) (16). Освен това, мишките, хранени с HFD-S, показват повишен бактериален товар, което предполага, че тяхната имунна система има нарушен капацитет да предотвратява бактериалното оцеляване и репликация в сравнение с тази на мишки, хранени с LFD (16). В настоящото проучване имахме за цел да сравним как полиненаситените и наситените хранителни мазнини влияят върху оцеляването и имунния отговор при сепсис. Също така изследвахме как хранителните мазнини влияят върху честотата и функцията на неутрофилите, ключовите клетки в защитата срещу сепсис и инфекции на S. aureus.

МАТЕРИАЛИ И МЕТОДИ

Експериментален протокол. Експерименталният дизайн е показан на фиг. 1. Шестседмични мъжки мишки C57BL/6 са получени от Harlan Netherlands B.V. (Horst, Холандия). Мишките бяха настанени в съоръжението за животни в Лабораторията за експериментална биомедицина, Университет в Гьотеборг, Гьотеборг, Швеция, при стандартни условия на светлина и температура. Водата и храната бяха осигурени по желание. Регионалният етичен комитет в университета в Гьотеборг одобри експериментите преди началото на изследванията. Започвайки на възраст от 7 седмици, мишките са били хранени с LFD, HFD-S или полиненаситена диета с високо съдържание на мазнини (HFD-P) в продължение на 8 седмици. На възраст от 14 до 15 седмици мишките бяха прекратени за измерване на имунни функции, използвайки поточна цитометрия или анализ на микрочипове, или интравенозно (i.v.), инокулирани със S. aureus. Заразените мишки бяха прекратени на 6-ия ден след i.v. инокулация за анализ на бактериален товар или на 17-ия ден в края на експериментите за оцеляване. Оцеляването се наблюдава ежедневно по време на оцеляването и експеримента с бактериално натоварване.

Експериментален дизайн. Седемседмични мишки бяха рандомизирани в една от различните диетични групи. След 8 седмици на диети, през 15 седмица, мишките бяха i.v. инокулиран със S. aureus, интраперитонеално (i.p.) инжектиран с тиогликолат за перитонеална промивка или прекратен за събиране на костен мозък и кръв за анализ на поточна цитометрия. Мишки i.v. инокулирани със S. aureus или са прекратени след 6 дни за анализ на бактериалното натоварване, или са наблюдавани непрекъснато до 17 дни за анализ на оцеляването. Мишките, инжектирани с тиогликолат, бяха прекратени след 4 часа и течността за перитонеална промивка беше анализирана. Съкращенията на експерименталната група бяха следните: LFD, диета с ниско съдържание на мазнини; HFD-S, наситена диета с високо съдържание на мазнини; HFD-P, полиненаситена диета с високо съдържание на мазнини; HP/C - HFD-S, високо съотношение протеин към въглехидрати и наситена диета с високо съдържание на мазнини; LP/C - HFD-S, ниско съотношение протеин към въглехидрати и наситена диета с високо съдържание на мазнини; HP/C - HFD-P, високо съотношение протеин към въглехидрати и полиненаситена диета с високо съдържание на мазнини; и LP/C - HFD-P, ниско съотношение протеин към въглехидрати и полиненаситена диета с високо съдържание на мазнини.

В последващо проучване, четири други диети са били използвани в продължение на 8 седмици. Тези диети са предназначени да изследват дали съотношението между протеини и въглехидрати е повлияло на оцеляването, когато източникът на мазнини и количеството се поддържат постоянни. Новите диети включват HFD-S с високо съотношение протеин към въглехидрати (HP/C HFD-S; 30% протеин, 10% въглехидрати), HFD-S с ниско съотношение протеин към въглехидрати (LP/C HFD -S; 10% протеин, 30% въглехидрати), HFD-P с високо съотношение протеин към въглехидрати (HP/C HFD-P; 30% протеин, 10% въглехидрати) и HFD-P с ниско съдържание на протеин- съотношение към въглехидрати (LP/C HFD-P; 10% протеин, 30% въглехидрати). Тези диети се хранеха по същия протокол като този за предишните диети. На 15-седмична възраст мишките бяха i.v. инокулиран със S. aureus и оцеляването се наблюдава ежедневно до ден 17 след инокулация, когато експериментът за оцеляване е прекратен.

Диети. Мишките бяха разделени на случаен принцип в групи, които получиха една от следните диети: LFD (D12450B; 3,9 kcal/g, 10 kcal% мазнини, 20 kcal% протеин, 70 kcal% въглехидрати; Research Diets, New Brunswick, NJ, USA), HFD-S (D12492; 5,2 kcal/g, 60 kcal% мазнини, 20 kcal% протеин, 20 kcal% въглехидрати; Изследователски диети) и HFD-P (D09020505; същият състав като HFD-S на мазнини, протеини и въглехидрати, но 69% от свинската мас е заменена за масло с менхен; Диети за изследване). Диетите бяха съпоставени, за да имат подобно съдържание, с изключение на състава на мазнините. Съставът на диетите е показан в Таблица 1.

Енергийна плътност и състав на експерименталните диети: наситени и полиненаситени диети

За експеримента, изследващ ефекта от различното разпределение на протеини и въглехидрати, групи мишки са били хранени или с 30 kcal% протеин и 10 kcal% въглехидрати, или с 10 kcal% протеин и 30 kcal% въглехидрати в продължение на 8 седмици. Тези две диети бяха комбинирани или с 60 kcal% наситени диетични мазнини (HP/C HFD-S [D13091403] и LP/C HFD-S [D13091404]; Изследователска диета) или с 60 kcal% полиненаситени мазнини (HP/C HFD-P [D13091405] и LP/C HFD-P [D13091406]; Изследователска диета). Съставът на тези диети е показан в Таблица 2.

Енергийна плътност и състав на експерименталните диети: протеинови и въглехидратни диети

Бактериална инокулация, оцеляване и бактериално натоварване. Мишките бяха заразени i.v. в опашната вена с 0,2 ml разтвор на S. aureus LS-1, съдържащ 3,8 × 10 7 до 4,5 × 10 7 CFU, както е описано по-рано (16). За определяне на бактериалното натоварване мишките бяха умъртвени 6 дни след i.v. инокулация и двата бъбрека бяха събрани асептично, хомогенизирани и разредени във фосфатно буфериран физиологичен разтвор (PBS) до подходящата концентрация. След това сто μl от всяка разредена проба се разпределя върху плаки с конски кръвен агар, които се инкубират при 37 ° С в продължение на 24 часа, преди да бъдат преброени бактериалните колонии. В експеримента за оцеляване мишките са наблюдавани и изследвани за признаци на тежка болест (неподвижна, изолация, пилоерекция, дехидратация и хипотермия) след i.v. инокулация. Когато една мишка показва три или повече от тези пет признака, мишката е евтаназирана и се счита за мъртва при сепсис.

Тегло и състав на тялото. Теглото на тялото се проследява от началото на диетите и всяка втора седмица до инокулацията. Мазнините и слабата телесна маса се анализират 3 дни преди инокулиране чрез двуенергийна рентгенова абсорбциометрия (PIXImus2; Lunar GE Medical Systems, Madison, WI, USA). По време на измерването мишките бяха под инхалационна анестезия с изофлуран (Forene; Abbot Scandinavia, Solna, Швеция).

Проточна цитометрия. (i) Събиране на костен мозък и кръв. Неинфектираните мишки се анестезират преди кръвта да се събере транскардиално в EDTA епруветки преди перфузия с физиологичен разтвор при налягане от 100 mm Hg за 10 минути. Клетките на костния мозък се събират от бедрената кост и пищяла и се съхраняват в PBS. И пробите от кръв и костен мозък се съхраняват на лед до подготовката.

(ii) Събиране на течност за перитонеална промивка. Неинфектираните мишки, използвани за перитонеална промивка, се инжектират с 1 ml 4% пивова тиогликолатова среда (SigmaAldrich, Сейнт Луис, МО, САЩ) в перитонеалната кухина, за да предизвикат локално възпаление. Четири часа след инжектирането мишките бяха упоени с изофлуран (абат Скандинавия) и умъртвени чрез дислокация на шийката на матката. Пет мл студен PBS се инжектират в перитонеалната кухина и се прави коремен масаж за 1 min. PBS се припомня и процесът се повтаря два пъти за общ обем перитонеална промивна течност от 15 ml. Пробите се държат на лед до приготвяне.

Анализ на микрочипове и събиране на данни. Клетките на костния мозък се събират от бедрената кост и пищяла чрез промиване на костите с RNAlater (Life Technologies). Пробите бяха оставени в хладилника за една нощ, както се препоръчва от компанията, центрофугирани и държани замразени до анализа. РНК се изолира с помощта на комплекта за липидна тъкан RNeasy (Qiagen Nordic, Sollentuna, Швеция), а количеството и качеството на РНК се оценяват съответно от NanoDrop (Thermo Scientific, Гьотеборг, Швеция) и Bioanalyzer (Agilent Technologies, Kista, Швеция). Двеста ng висококачествена РНК от всяка проба беше приготвена и хибридизирана с Affymetrix миши ген 1.0 ST масиви съгласно препоръчания протокол на Affymetrix. Хибридизацията и анализът бяха извършени в съответствие с инструкциите на производителя в основното съоръжение на SCIBLU Genomics (Център за интегративна биология Swegene към университета в Лунд, Лунд, Швеция).

РЕЗУЛТАТИ

HFD-P повишава експресията на катепсин D гена в костния мозък. Ниво на експресия на катепсин D, от анализ на микрочипове в костния мозък, след 8 седмици от различните диети при незаразени мишки. Данните бяха оценени с помощта на умерен t тест на Student и са показани като средни стойности ± SEM, с n = 4 на група. Две звездички показват, че коригираното P съотношение протеин/въглехидрати не е повлияло преживяемостта. За да се изследва дали съотношението между протеини и въглехидрати влияе върху преживяемостта при сепсис, диети с 60% мазнини, предимно наситени или полиненаситени, се комбинират с 30% протеини и 10% въглехидрати (HP/C) или 10% протеини и 30% въглехидрати (LP/C) и хранени на мишки в продължение на 8 седмици. Нямаше разлика в оцеляването след i.v. инокулация на S. aureus между мишки, хранени с наситени мастни киселини, комбинирани с някоя от двете различни пропорции на протеин и въглехидрати, HP/C HFD-S или LP/C HFD-S. По същия начин няма разлика между мишките, хранени с полиненаситени мастни киселини, комбинирани с някоя от двете различни пропорции на протеин и въглехидрати, HP/C HFD-P или LP/C HFD-P (Фиг. 7). Степента на преживяемост обаче е по-висока (съотношение на риска, 0,17; P = 0,001) при мишки, хранени с полиненаситени мастни киселини, отколкото при тези, хранени с наситени мастни киселини, в съответствие с резултатите, показани на фиг. 2А.

Съставът на протеини или въглехидрати не повлиява оцеляването. Показано е оцеляването след 8 седмици при различни диети от 0 до 17 дни след S. aureus i.v. инокулация, с п = 20 мишки на група. Регресията на Кокс беше извършена с източник на мазнини и пропорция на протеини като фактори, където диетите с полиненаситени мастни киселини имаха намален риск в сравнение с диетата с наситени мастни киселини (съотношение на риск, 0,17; P = 0,001), а високо протеиновата диета нямаше разлика в риска диетата с високо съдържание на въглехидрати (съотношение на риска 0,8; P = 0,6). ***, P S. aureus инфекция. Мишките, хранени с HFD-P, са имали по-високо ниво на оцеляване от мишките, хранени с HFD-S, и не са се различавали по отношение на оцеляването в сравнение с мишките, хранени с LFD. В съответствие с това, мишките, хранени с HFD-P и LFD, са имали по-ниско бактериално натоварване в бъбреците си, отколкото мишки, хранени с HFD-S, което показва, че мишките, хранени с HFD-P или LFD, имат по-добра защита срещу индуциран от S. aureus сепсис. Тези открития потвърждават и разширяват нашето предишно проучване, показващо нарушен имунен отговор при мишки, хранени с HFD-S, в сравнение с мишки, хранени с LFD (16). Настоящото проучване предполага, че диетата с високо съдържание на мазнини сама по себе си не е непременно вредна, а по-скоро, че високата степен на насищане на мазнините влошава имунния отговор.

Като се има предвид, че 8-седмично излагане на диета HFD-S предизвиква затлъстяване, увреждането на имунния отговор към S. aureus може да бъде причинено директно от диетата или да е вторично за затлъстяването. Нашите по-ранни проучвания показват, че затлъстяването само по себе си влияе върху защитата срещу индуциран от S. aureus сепсис, тъй като ob/ob (затлъстелите) мишки на LFD имат по-ниско ниво на оцеляване от мишки от див тип (16). Настоящите резултати обаче предполагат, че HFD-P може да предпазва от инфекции независимо от ефекта му върху затлъстяването. Въпреки че мишките, хранени с HFD-P, са по-затлъстели от мишки, хранени с LFD, няма разлика в преживяемостта между мишки, хранени с HFD-P- и LFD. Освен това няма разлика в чистата маса между трите групи, което показва, че този аспект на телесния състав не медиира ефектите на диетата върху защитата срещу сепсис.

За да се изследва дали миграционният капацитет на неутрофилите също е бил повлиян от диетата, тиогликолатът се инжектира в перитонеалната кухина. Всъщност, честотата на неутрофилите в перитонеалната промивна течност от мишки, хранени с HFD-P и LFD, е увеличена в сравнение с тази на мишки, хранени с HFD-S, което показва, че неутрофилите в тези мишки имат повишен миграционен капацитет. Тази констатация все още е налице, когато се вземе предвид, че честотата на неутрофилите в костния мозък е увеличена при мишки, хранени с HFD-P, в сравнение с мишки, хранени с LFD или HFD-S (данните не са показани).

Увеличението на неутрофилите на костния мозък при мишки, хранени с HFD-P, ни подтикна да изследваме прогениторните клетки в този орган. HFD-P има по-висока честота на прекурсорни клетки, отколкото мишки, хранени с HFD-S. CD117 или c-Kit е рецепторът за фактор на стволови клетки/стоманен фактор и е цялостен маркер на хемопоетични предшественици (26). Спекулираме, че мишките, хранени с HFD-P, са по-подготвени да мобилизират бързо защитата на левкоцитите като цяло за борба с бактериите благодарение на по-високите нива на хемопоетични клетки-предшественици.

Катепсин D е лизозомен протеин, открит в полиморфноядрени левкоцити, моноцити и макрофаги (27) и е важен за регулиране на апоптозата (22, 28). В настоящото проучване мишките, хранени с HFD-P, имат по-високи нива на катепсин D иРНК в костния мозък, отколкото мишките, хранени с HFD-S. Предишни проучвания показват, че дефицитът на катепсин D води до нарушен бактериален клирънс (29, 30). Това е в съответствие с нашите резултати, при които мишките, хранени с HFD-P, имат по-висока експресия на катепсин D и намалено бактериално натоварване.

Предполага се, че съотношението между хранителните протеини и въглехидратите влияе върху имунната система (31–33). В настоящото проучване съотношението протеин/въглехидрати не повлиява преживяемостта по време на сепсис. Вместо това пропорциите между наситените и полиненаситените мазнини оказаха голямо влияние, в съответствие с резултатите, обсъдени по-горе. Взети заедно, резултатите от настоящото проучване показват, че разпределението между наситени и полиненаситени мастни киселини оказва силен ефект върху септичната преживяемост, независимо от големи вариации в съдържанието на протеини и въглехидрати в диетата.

В обобщение, мишките, хранени с HFD-P, изглежда имат по-голям капацитет за борба с инфекцията със S. aureus, отколкото мишките, хранени с HFD-S. Причината за това е неизвестна, но може да е свързана с факта, че мишките, хранени с HFD-P, са имали по-висока честота на неутрофили в костния мозък и кръвта преди инфекцията. Нещо повече, мишките, хранени с HFD-P, са имали по-висока честота на неутрофилите в перитонеална промивна течност след индуцирано от тиогликолат възпаление; по този начин тези мишки изглежда имат по-ефективен хемотаксис от неутрофилите от мишки, хранени с HFD-S.

ПРИЗНАВАНИЯ

Тази работа беше подкрепена от Шведския изследователски съвет (№ K2013-54X-09894-19-3) и финансирането от Европейската рамкова програма 7 (Full4Health; договор № FP7-KBBE-2010-4-266408).

Ние признаваме SCIBLU Genomics (Swegene Center for Integrative Biology) в университета в Лунд, Швеция, за хибридизации на микрочипове.

Потвърждаваме, че нямаме конфликт на интереси.