Отделение за клетъчна биология и анатомия, Университет в Маями, Училище по медицина Милър, Маями, Флорида, Съединени американски щати

дългосрочното

Отделение по неврология на Университета в Маями, Медицински факултет на Милър, Маями, Флорида, Съединени американски щати

Отделение по неврология на Университета в Маями, Медицински факултет на Милър, Маями, Флорида, Съединени американски щати

Катедра по принадлежност към генетиката, Университет на Уисконсин, Мадисън, Уисконсин, Съединени американски щати

Отделение за клетъчна биология и анатомия, Университет в Маями, Училище по медицина Милър, Маями, Флорида, САЩ, Департамент по неврология, Университет в Маями Милър, Медицинско училище, Маями, Флорида, Съединени американски щати

  • Лой М. Дилън,
  • Алине Хида,
  • София Гарсия,
  • Томас А. Прола,
  • Карлос Т. Мораес

Фигури

Резюме

Цитат: Dillon LM, Hida A, Garcia S, Prolla TA, Moraes CT (2012) Дългосрочното лечение с безафибрат подобрява фенотипите на кожата и далака на мутаторната мишка mtDNA. PLoS ONE 7 (9): e44335. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0044335

Редактор: Йидонг Бай, Здравен научен център на Тексаския университет в Сан Антонио, САЩ

Получено: 28 май 2012 г .; Прието: 1 август 2012 г .; Публикувано: 4 септември 2012 г.

Финансиране: Тази работа беше подкрепена от безвъзмездните средства на Американската служба за обществено здраве (PHS) AG036871, EY010804, NS079965; Асоциацията за мускулна дистрофия и Фондацията за биомедицински изследвания във Флорида. Финансистите не са играли роля в дизайна на проучването, събирането и анализа на данни, решението за публикуване или подготовката на ръкописа.

Конкуриращи се интереси: Авторите са декларирали, че не съществуват конкуриращи се интереси.

Въведение

Много скорошни изследвания свързват митохондриалната дисфункция със стареенето и свързаните със стареенето заболявания [1]. Мутаторната мишка с митохондриална ДНК (mtDNA) е миши модел на преждевременно стареене, който поддържа тази връзка. Тази мишка има мутантна mtDNA полимераза γ (POLG), която няма своята коректорска способност [2], [3]. Показано е, че мутаторните мишки (обозначени като Mut мишки) развиват много характеристики на преждевременното стареене като ранна загуба на коса, анемия, остеопороза, саркопения, кардиомиопатия и намалена продължителност на живота [2], [3]. Тези фенотипове, подобни на стареене, са свързани с повишена мутация на mtDNA и митохондриална дисфункция [2], [3]. Наскоро показахме, че повишаването на митохондриалната биогенеза и функционирането на мускулите, чрез трансгенна свръхекспресия на активиран от пероксизома пролифератор рецептор (PPAR) γ коактиватор-1α (PGC-1α), подобрява фенотипите на скелетните мускули и сърцето на мишките Mut [4].

В опит да компенсираме митохондриалната дисфункция при мишката Mut, ние ги поставихме на безафибратна диета (BD) за 8 месеца. Тук показваме, че безафибратът не е увеличил няколко тествани маркера на митохондриално съдържание/функция; обаче, забавя загубата на коса и драстично подобрява фенотипа на кожата и далака на мишките Mut. Тези резултати предполагат, че активирането на PPAR може да има благоприятни ефекти в определени тъкани, подложени на митохондриален стрес.

Резултати

Системни ефекти на безафибрат в мишката-мут

За да се подобри митохондриалната функция във всички тъкани, 2-месечни мъжки мишки Mut бяха поставени на стандартна миша диета, съдържаща 0,5% безафибрат (BD). Тази група мишки е наричана досега като MutBD. За да гарантираме, че промените, наблюдавани при MutBD мишки, се дължат на безафибрат, ние също поставихме 2-месечни WT мишки върху BD (наричани досега WTBD). Мишките на BD са сравнени със същите възрастни мъжки мишки Mut и WT, които са били хранени със стандартна миша диета (стандартна диета, SD). Тези мишки ще бъдат посочени съответно като MutSD и WTSD. Животните са хранени със съответните си диети в продължение на 8 месеца и след това са анализирани на 10-месечна възраст, за да се разкрият ефектите от продължителното приложение на безафибрат върху физическия фенотип, структурата/функцията на органи и митохондриалната функция в модел на стареене на митохондриите.

По-рано беше показано, че мишката Mut има намалено телесно тегло в сравнение с WT мишки [2], [3]. Следователно, ние наблюдавахме промените в телесното тегло и при двете мишки на BD и SD месечно, започвайки от 2-месечна възраст. Подобно на предишни доклади, открихме, че при 3-месечни по-стари MutSD мишки са имали по-ниско телесно тегло в сравнение с WT мишки (фиг. 1А). Наблюдавахме, че мишките от всички групи имат сходно телесно тегло при 2-месечна възраст, но само при WTSD мишките се наблюдава постоянно нарастване на телесното тегло между 4 и 11-месечна възраст (фиг. 1А). Също така открихме, че MutBD и WTBD мишките тежат по-малко от MutSD и WTSD мишките съответно, започвайки на 3-месечна възраст (Фиг. 1А). Тази разлика в телесното тегло не се дължи на намаляване на приема на храна от мишки MutBD (не е показано). Тези резултати показват, че безафибратът намалява телесното тегло както на Mut, така и на WT мишки.

(А) Телесно тегло на мишки на възраст от 2 до 14 месеца (n = 11-26/група за 2 до 11 месеца; 2-6/група за 12 до 14 месеца). Разликата в телесното тегло между WTSD и MutSD мишки е статистически значима от 3 до 14 месеца, между WTSD и WTBD мишки е значима във всеки момент от време и разликата между MutSD и MutBD е значителна от 3 до 14 месеца. Измерване на общата (B) костна минерална плътност (BMD), (C) костно минерално съдържание (BMC) (D), телесна площ (cm 2), чиста маса (g), обща телесна мазнина (g) и проценти (%) мазнини на 10-месечни мишки (n = 5-7/група). (E) Процент оцеляване на мишки (n = 11-15/група). *, P Фигура 2. Безафибратът забавя загубата на коса и възстановява структурата на кожата на мишки Mut.

(А) Снимки на мишки на 7-месечна и 10-месечна възраст, показващи фенотипа на козината им (n = 6/група). Квадратите подчертават областта на козината, която се описва. (B) Дорзални кожни участъци от 10-месечни мишки, показващи оцветяване с хематоксилин и еозин (H&E) за изобразяване на структурни промени (черна стрелка показва счупване в епидермисния слой на мишки MutSD), оцветяване на Van Geison (EVG) на Verhoeff за еластични влакна, показано в черно/тъмно кафяво (жълта стрелка) и трихромовото оцветяване на Masson, показващо колаген в синьо (n = 2/група). (C) Western blot, показващ нивата на общия Smad3 и глицералгехид 3-фосфат (GAPDH) в общия кожен хомогенат от 10-месечни мишки и количествено определяне на общия интензитет на Smad3 лента, нормализиран към GAPDH (n = 4/група). Лентите за грешки представляват SEM.

За по-нататъшно характеризиране на ефектите на безафибрата върху косопада и побеляването, дорзалната и вентралната кожа са събрани от 10-месечни мишки WTSD, MutBD и MutSD. Парафиновите вградени кожни участъци бяха оцветени с хематоксилин и еозин (H&E), за да се определят структурните промени. Наблюдавахме, че гръбните кожни участъци от MutSD мишки са по-тънки и им липсват отчетливите слоеве, които присъстват при WTSD мишки, докато MutBD мишките имат кожна структура, по-подобна на WTSD мишки (Фиг. 2В, H&E). По-конкретно, гръбните кожни участъци от мишките MutSD са съставени предимно от дермата/съединителната тъкан и са имали не-непрекъснат епидермисен слой (фиг. 2В, H&E). Освен това кожните участъци от мишките MutSD имат по-малки космени фоликули в сравнение с мишките WTSD и MutBD (не е показано). Не са наблюдавани отчетливи структурни разлики в вентралните кожни участъци от тези последни мишки, което предполага, че гръбната кожа може да бъде по-податлива на увреждане на митохондриалната ДНК. (не е показано).

Тъй като колагеновите и еластиновите влакна са основните функционални компоненти на дермата/съединителнотъканния слой на кожата [12], ние искахме да определим дали безафибратът оказва влияние върху експресията на тези компоненти. За откриване на еластинови влакна и колаген, гръбните кожни участъци бяха оцветени съответно с трихромовото оцветяване на Verhoeff’s Van Geison (EVG) и Masson’s. Установихме, че еластиновите влакна (черно/тъмнокафяво оцветяване) присъстват в съединителната тъкан както на MutSD, така и на MutBD мишки на нива, подобни на WTSD мишки (Фиг. 2B, EVG). Въпреки това, в сравнение с WTSD мишки, MutSD мишките по същество нямат колаген (синьо петно) в съединителната тъкан на кожата (фиг. 2В, трихром на Masson). Изненадващо, нивата на колаген в кожата бяха възстановени при мишки MutBD (фиг. 2В, трихром на Masson).

Показано е, че трансформиращият растежен фактор бета 1 (TGF-β1)/Smad3 сигнален път регулира редица промотори на колагенови гени в човешки дермални фибробласти [13]. Също така беше показано, че активираният PPARδ може да регулира нивата на колаген в кожата по пътя на TGF-β1/Smad3 [14]. Тъй като безафибратът е PPARδ агонист, искахме да определим дали този път е бил активиран в кожата на 10-месечни мишки MutBD. Извършихме уестърн блот за Smad3 в тотален хомогенат от кожата на 10-месечни мишки. Нашите резултати показаха натрупване на общ Smad3 протеин в кожата на WTBD и MutBD мишки в сравнение с WTSD и MutSD мишки (Фиг. 2C). По-рано беше доказано, че натрупването на общ Smad3 протеин е свързано с повишена сигнализация на Smad2/3 в човешки дермални фибробласти [15]. Следователно, нашите резултати предполагат, че безафибратът активира пътя на TGF-β1/Smad3, като по този начин причинява увеличаване на колагена в кожата на мишки MutBD.

Bezafibrate Намалява размера на далака и възстановява структурата на далака на мишки

По-рано беше показано, че при мишките с мута се разширяват някои органи, един от които е далакът [2]. Установихме, че безафибратът намалява теглото и размера на далака на 10-месечни мишки MutBD и WTBD (фиг. 3А и 3В). Размерът на далака на MutBD мишки беше възстановен до този на WTSD мишки (Фиг. 3А). За по-нататъшно изследване на този ефект на безафибрат върху далака на Mut и WT мишки, ние извършихме H&E оцветяване на парафинови секции от далак. Установихме, че безафибратът подобрява структурата на далака на мишките MutBD (фиг. 3D). Нашите резултати показаха, че MutSD мишките имат аберантна структура на далака, характеризираща се с подчертана атрофия и намалена бяла пулпа (лилави области на фиг. 3D) и увеличаване на червената пулпа на далака (фиг. 3D). Тъй като бялата пулпа на далака синтезира антитела, атрофията на тази област при MutSD мишки може да наруши техния имунен отговор [16]. Интересното е, че далакът на мишките MutBD има разпределение и организация на пулпа в бяло и червено, които са подобни на мишките с WTSD (фиг. 3D). Тези открития показват, че безафибратът е защитил далака в мишката Mut.

(A) Тегло на далака на 10-месечни мишки и (B) картина на далак от Mut мишки (n = 4-6/група). (C) Количествено определяне на разцепена каспаза-3 имунооцветяваща в парафинови секции от далака на 10-месечни мишки (n = 3-4/група). *, P 6 µl) (n = 5–6/група) (F) нива на PGC-1α и PPARy mRNA в далака на 10-месечни мишки, нормализирани на актин. (G) Количествено определяне на Western blot, показващо нива на митохондриален протеин в общия хомогенат от далака на 10-месечни мишки, нормализирани към актин. NADH дехидрогеназа (убихинон) 1β подкомплекс субединица 8 (NDUFB8; субединица на комплекс I), сукцинат дехидрогеназа субединица B (SDHB; субединици на комплекс II), убихинол-цитохром c редуктаза ядро ​​протеин 2 (UQCRC2; субединица AT на комплекс от комплекс III синтаза субединица 5α (ATP5A; субединица на комплекс V). *, P Фигура 4. Ефектът на безафибрата върху скелетните мускули на мишки Mut и WT.

Тук показахме, че безафибратът подобрява някои преждевременни стареещи фенотипове на мишки Mut, най-ясно наблюдавани в кожата и далака. Наскоро беше показано, че митохондриалната дисфункция в соматичните стволови клетки може да допринесе за прогероидните фенотипове, налични при Mut мишки [21]. Следователно, нашите открития предполагат, че безафибратът може да помогне за поддържане на популацията от стволови клетки при репликиране на тъкани като кожа и далак при мишките Mut. Интересното е, че наблюдаваните ползи не корелират с генерализирано повишено съдържание или функция на митохондриите и могат също да бъдат резултат от ефектите на PPAR в други свързани регулаторни пътища, участващи в контрола на възпалението, метаболизма на мастните киселини и апоптозата.

Материали и методи

Модел на мишката

MtDNA мутаторни мишки (Polg D257A/D257A) (Mut) преди това бяха характеризирани [2], [3]. Поставихме 2-месечни мъжки мишки Mut и WT (съответно MutBD и WTBD) на стандартна миша диета, съдържаща 0,5% безафибрат (безафибратна диета, BD) (Bio-Serv). Като контрола поставихме мъже Mut и WT от една и съща възраст на стандартната диета за мишки (стандартна диета, SD) (съответно MutSD и WTSD). Мишките бяха държани на съответните си диети в продължение на 8 месеца и анализирани на 10-месечна възраст. Ние избираме да използваме само мъжки мишки, за да намалим общия брой животни, използвани за нашето проучване, а също и да избегнем експериментална вариабилност, наблюдавана при женски животни поради техния естрозен цикъл.

Животновъдство

Мишките бяха настанени в обект без вируси на антиген към Отдела за ветеринарни ресурси на Университета в Маями в 12-часов цикъл светлина/тъмнина при 22 ° C и хранени ad libitum с облъчена стандартна миша диета или безафибратна диета.

DEXA сканиране

Тази процедура е извършена, както е описано по-рано [22]. В обобщение, мишките се анестезират, след което се претеглят и се измерва минералната плътност и съдържание на костите, заедно с мазнини и чиста телесна маса, като се използва лунен денситометър PIXImus II (GE Medical Systems, Waukesha, WI).

Хистология

Гръбната и вентралната кожа на евтаназирани мишки бяха обръснати, а биопсиите на кожата бяха събрани и съхранявани във формалин в продължение на поне 24 часа, преди да бъдат изпратени в хистологичното ядро ​​на Университета в Маями Lois Pope Center за вграждане на парафин. Парафиновите кожни участъци бяха оцветени с хематоксилин и еозин (H&E), Van Geison на Verhoeff’s (EVG) и трихромово оцветяване на Masson в Университета на Маями по дерматологична патологична сърцевина. Оцветените срезове бяха анализирани с помощта на светлинен микроскоп. За анализ на далака и черния дроб, дълбоко упоените мишки бяха перфузирани със студен PBS и черният дроб и далакът бяха събрани и съхранявани във формалин за най-малко 24 часа. След това фиксираните тъкани бяха вградени в парафин, разрязани, оцветени за H&E и анализирани за структурни промени в лабораторията за сравнителна патология на Университета в Маями.

Имунооцветяване

Парафиновите вградени секции на далака се затоплят, след това се депарафинизират и рехидратират. Секциите бяха инкубирани в 70% мравчена киселина за извличане на антиген, преди да бъдат проникнати с 0,2% Triton. Ендогенните пероксидази бяха угасени, след което секциите бяха блокирани за 1 час с нормален кози серум (KPL). Секциите се инкубират за една нощ в 1 250 разредба на първично антитяло за разцепена каспаза-3 (клетъчно сигнализиране). Използвано е вторично антитяло, биотинилирано козе анти-заешко (KPL), след което участъци са третирани със стрептавидин пероксидази (KPL) в продължение на 30 минути, преди да бъдат инкубирани в диаминобензидин (DAB). Слайдовете се дехидратират в алкохол, след това се монтират в ксилол с водна среда за монтиране и се гледат със светлинен микроскоп. Броят на положителните (кафяви) оцветявания се отчита в 4 зрителни полета от всяка секция и се осреднява.

Западно петно

Уестърн блот се извършва, както е описано по-рано [23]. Използвани първични антитела са Smad3 (клетъчно сигнализиране), GAPDH (GeneTex), общ коктейл от гризачи OXPHOS (Mitosciences), PGC-1α (Santa Cruz H-300) и актин (Sigma). Първичните антитела бяха използвани при 1 1000 разреждания, с изключение на PGC-1α, който беше използван при 1 200 разреждания, и инкубирани през нощта при 4 ° С. Използваните вторични антитела са конюгирани с инфрачервена светлина анти-заек 700 (1∶3000) и анти-мишка 800 (1∶5000) (Rockland) и кози анти-заешки HRP-свързани (1∶1000) (клетъчна сигнализация). Blots или са визуализирани с инфрачервена система за изображения на Odyssey (LI-COR Biosciences) и интензивността на лентата, количествено определена със софтуер по подразбиране, предоставен от LI-COR, или са визуализирани с разработчик на рентгенови филми и интензитет на лентата, количествено измерена със софтуера ImageJ.

Количествена PCR

Обща РНК беше изолирана от бързо замразена тъкан, използвайки RNeasy Fibrous Tissue Mini kit (за квадрицепси) и RNeasy Mini kit (за черен дроб и далак) (Qiagen). cDNA се синтезира от 1 ug RNA, използвайки iScript cDNA комплект за синтез (BIO-RAD). Количествена PCR в реално време, със специфични праймери за PGC-1α (5′-CTGCGGGATGATGGAGACA, 5′-AGCAGCGAAAGCGTCACA), PGC-1β (5′- TGGCCCAGATACACTGACTATG,

5′- TGGGCCTCTTTCAGTAAGCT), PPARα (5′- TTCCCTGTTTGTGGCTGCTAT,

5′- CCCTCCTGCAACTTCTCAATGTAG), PPARγ (5′- CGGAAGCCCTTTGGTGACTTTA,

5'GCGGTCTCCACTGAGAATAATGAC), PPARδ (5'ACCGCAACAAGTGTCAGTAC, 5'CTCCGGCATCCGTCCAAAG), ACOX (5'ACCGCCTATGCCTTCCACTTTC, 5'GCAAGCCATCCGACATTCTTCG), CD36 (5'CCAAATGAAGATGAGCATAGGACAT, 5'-GTTGACCTGCAGTCGTTTTGC), CPT1 (5' TTTCGACAGGTGGTTTGAC, 5′- TCTGCGTTTATGCCTATCTTG), SCAD (5′- CCTGGATTGTGCTGTGAA, 5′- TGTCTGCCAGCTTGAACT) и β-актин (5′-TGACAGGATGCAGAAG,

5′-GCGCTCAGGAGGAGCAAT) беше извършен с помощта на SsoAdvanced SYBR Green (BIO-RAD). Количеството на MtDNA копие е количествено определено, както е описано по-горе [4]. Методът ΔΔCt се използва за определяне на относителното изобилие на всеки ген.

Спектрофотометрични анализи

Активността на цитрат синтазата (CS) се определя спектрофотометрично в общия хомогенат от квадрицепсите на мишки, както е описано по-рано [4]. Резултатите от анализа бяха нормализирани до концентрацията на протеин, получена по метода на Брадфорд.

Тест за бягаща пътека

Тестът на бягащата пътека е извършен, както е описано по-рано [4]. Мишките първо бяха приведени в бягаща пътека (Columbus Instruments, Columbus, OH), след което бяха пуснати да работят с 9 метра в минута за 3 минути. Ефективността на мишките се определя от броя на паданията на мишката от бягащия колан върху решетката по време на теста.

Анализ на кръвта

Мишките се гладуват през нощта и на следващия ден се анестезират и кръвта се събира чрез сърдечна пункция. Кръв е изпратена до Лабораторията за сравнителна патология на Университета в Маями за анализ на пълния брой на кръвните клетки (CBC) и за кръвен панел на черния дроб за измерване на маркери за чернодробно увреждане/възпаление.

Декларация за етика

Това проучване е проведено в строго съответствие с препоръките в Ръководството за грижа и употреба на лабораторни животни от Националните здравни институти. Протоколът е одобрен от Комитета по етика на опитите с животни към Университета в Маями (Номер на разрешителното: 12-094). Всички усилия бяха положени да сведат до минимум страданието.

Благодарности

Благодарни сме на д-р Tongyu Cao за съдействието при анализ на кожата, г-жа Estefania Gonzalez за помощ при подготовката на РНК, д-р Wayne Balkan за достъп до скенера DEXA, лабораторията за сравнителна патология на Университета в Маями и ядрото по дерматология за хистологично оцветяване/анализ и Actavis Pharmaceuticals за щедрия дар от безафибрат.

Принос на автора

Замисля и проектира експериментите: LMD CTM. Изпълнени експерименти: LMD AH SG. Анализирани данни: LMD CTM. Реактиви/материали/инструменти за анализ, допринесени: TP. Написа хартията: LMD CTM TP.