Даниел Шленк, Уилям С. Коли, Абир Ел-Алфи, Ричард Кирби, Били Р. Грифин, Ефекти на оксидантния калиев перманганат върху експресията на мРНК на хрилни металотионеини и неговата връзка с крайните точки на сублетални цели животни в каналски сом, Токсикологични науки, том 54, брой 1, март 2000 г., страници 177–182, https://doi.org/10.1093/toxsci/54.1.177

окислителния

Резюме

Перманганатният йон, MnO4 –2, получен от PM, е силен окислител и PM се използва като общ биоцид при препоръчителни концентрации до 4 mg/L в различни условия на аквакултурата. Използва се също като дезинфектант в люпилни за риби за водни растения, аквариуми, писти, езера и водоснабдяване; за премахване на рибни паразити; за намаляване или предотвратяване на болести, особено върху рани от риби; за детоксикация на рибни токсични вещества като ротенон и антимицин; за контрол на гъбички и водорасли; и за отстраняване на временните проблеми с изчерпването на кислорода в водоемите за култивиране (Duncan, 1978; Tucker, 1984). Токсичността на PM очевидно е насочена към хрилете, тъй като се наблюдава нарушаване на осморегулаторната функция при сьомга, преминаваща в солена вода след лечение с PM (Brouck and Johnson 1979). Тъй като MnO4 2 е силен окислител, механизмът на токсичност може да бъде медииран чрез оксидативен стрес, който може да възникне, ако значителни концентрации на манган (Mn) се абсорбират в клетката. Един потенциален защитен механизъм, предпазващ от оксидативен стрес в рибните клетки, е индукцията на сулфхидрил-съдържащия полипептид металотиоин (MT) (Waalkes и Klaassen 1985).

Металотионеините (MTs) са протеини с ниско молекулно тегло, осигуряващи защита от метална токсичност и оксидативен стрес в много организми (Kagi и Schaffer 1988). Въпреки че притежава силна степен на структурна хомология през цялата филогения, изглежда има значителни разлики в експресията на MT между видовете, особено при видовете риби (Olsson 1993, 1996). Последните проучвания, изследващи механизмите на регулация на МТ, показват разлики в елементите на отговор, които са важни за започване на транскрипция на МТ гени (Kille et al., 1991). Каналният сом (Ictalurus punctatus) е доста устойчив на множество химикали, включително много органични пестициди и метали (Perkins и Schlenk, в пресата; Zhang и Schlenk, 1995). По-ранни проучвания показват относително големи вътреклетъчни концентрации на глутатион и антиоксидантни ензими (Hasspieler et al., 1994). Въпреки това, малко се знае по отношение на ролята на МТ в устойчивостта на сомовите канали към окислително активни химикали.

Предишни проучвания показват, че експресията на чернодробна МТ се индуцира от няколко метала в сомовете в канала, включително кадмий (Zhang и Schlenk 1995), мед (Perkins et al., 1996), цинк (Schlenk et al., 1997a) и арсен (Schlenk et ал., 1997b). Въпреки че е доказано, че Mn индуцира чернодробна МТ in vivo при гризачи (Waalkes и Klaassen 1985), очевидно го прави чрез непряк механизъм, тъй като нивата на МТ в изолирани хепатоцити всъщност са намалени при лечение с Mn без промяна в клетъчната жизнеспособност (Bracken и Клаасен 1987).

Експресията на МТ може да бъде измерена на нивото на протеина (Schlenk et al., 1997b), както и на иРНК (Schlenk et al., 1997a; Zhang and Schlenk, 1995). Наскоро беше използвана количествена верижна реакция на обратна транскриптаза полимераза (RT-PCR) за измерване на експресията на MT mRNA в сом канал, изложен на няколко метала (Schlenk et al., 1997a). За съжаление, точната нуклеотидна последователност на ампликона никога не е била идентифицирана в нито едно от тези проучвания. По този начин целите на това проучване бяха да се клонира и секвенира предварително идентифицирана кДНК, получена чрез RT-PCR, индуцирана от няколко метала, и да се определи връзката между експресията на транскрипта и сублеталните крайни точки на цели животни, указващи токсичността при сом от канал.

МАТЕРИАЛИ И МЕТОДИ

За изследването са получени канални сомове, както е описано по-рано (Griffin et al., 1999). Рибите са били отглеждани в закрити, поточни резервоари, снабдени с кладенческа вода, за да се избегне излагането в глинени езера, които съдържат манган. Единствените източници на манган, достъпни за рибите, освен добавените по време на проучването, са снабдяването с храна и вода. Характеристиките на качеството на водата по време на проучването са както следва: температура 21,5 ± 0,5 ° C; рН 7,6 ± 0,2; кислород 7,7 ± 0,2 mg/L; алкалност 184 ± 3 mg/L (като CaCO3); общ амоняк 0,91 ± 0,04 mg/L; и нейонизиран амоняк 0,03 ± 0,01 mg/L.

На рибите се предлагаше търговска храна за сом ежедневно в размер на 2% от телесното тегло, а непоядената храна се отстранява в рамките на 1 час. Съдържанието на манган в използвания фураж е 231 ± 18 mg/kg (n = 7 тествани проби). Технически клас калиев перманганат, използван за това проучване, е предоставен от Carus Chemical Company (Ottawa, IL); чистотата е оценена на 97%.

Шест сома (3 мъжки и 3 женски) бяха отстранени от всяка група за вземане на проби преди започване на излагане на манган и на интервали от 2 седмици до края на проучването. Полът се определя чрез визуална инспекция на външни гениталии. Рибите бяха зашеметени от удар в главата и гръбначният мозък беше прекъснат при първия шиен прешлен. Хрилете се събират от всяка риба, опаковат се индивидуално в държачи за проби без манган, индексират се и се съхраняват при –85 ° C, докато се анализира за MT mRNA. Измерванията на телесно тегло, телесна дължина, чернодробно тегло, фактор на състоянието ((телесно тегло (телесно тегло) × 100/телесно тегло 3) и LSI (чернодробно тегло/[телесно тегло - чернодробно тегло]) са записани като мерки за сублетална токсичност.

За RT-PCR проучвания, млади сомови канали (на 6 месеца) с тегло от 100–155 g се инжектират интраперитонеално с 10 mg/kg кадмиев хлорид, както е описано по-рано (Schlenk et al., 1997a). След 24 часа животните бяха евтаназирани с последваща дисекция на черния дроб. Всяка тъкан се замразява в течен азот и се съхранява при –80 ° C, докато се обработи за РНК.

Изолиране на РНК и северно петно

Общата РНК се извлича от приблизително 100 mg рибешки хриле с помощта на реагент Tri (Molecular Research Center, Inc., Cincinnnati, OH). Крайната РНК пелета се разтваря в обработена с DEPC вода и концентрацията се измерва с помощта на Hitachi U-2000 спектрофотометър при 260 nm. Целостта на РНК се проверява чрез електрофореза в агарозен гел чрез наблюдение на 28S, 18S и 5.8S рибозомни и трансферни РНК ленти. Северното попиване се извършва при използване на стандартни процедури, описани по-рано (Schlenk et al., 1997a, b; Zhang and Schlenk, 1995). Лентите се определят количествено чрез сканиране на денситометрия с помощта на софтуера NIH Image (версия 1.61).

RT-PCR

Синтезът на cDNA беше осъществен с помощта на комплекта за синтезиране на cDNA от първа верига (Boehringer Manheim, Indianopolis, IN), както беше описано по-рано (Schlenk et al., 1997a). Праймерът RACE-T (5`-CCGAA TTCTC GAGAT CGATT TTTTT TTTTT TT-3`) беше използван за първичен синтез на кДНК от първа верига. За PCR амплификация, RACE праймерът (5`CCGAA TTCTC GAGAT CGA-3`) и дегенериращият, универсален MT праймер (5`-ATGGA TCCNT GCGAA TG-3`) на базата на 6 N-терминални кодони на писцински MT гени Chan 1994). Праймерите са получени от National Biosciences, Inc. (Plymouth MN). За реакцията RT бяха използвани 1.0 μg РНК в общ реакционен обем от 50 μl, съдържащ 1 х реакционен буфер, 5 mM MgCl2, 1 mM DNTP смес, 50 ​​единици инхибитор на RNase, 20 единици AMV обратна транскриптаза и 10 ng на грунд RACE-T. Реакционната смес се инкубира при 42 ° С за 1 h и след това се разрежда със 150 μl вода, до общ обем от 200 μl.

Основната смес на PCR съдържа 2,5 единици Taq ДНК полимераза в 20 mM Tris – HCl, 100 mM KCl, 3 mM MgCl2, 0,01% Brij r 35 (v/v), dNTP смес (dATP, dCTP, dGTP, dTTP), всяка по 0,4 mM, pH 8.3 (20 ° C) в краен обем от 50 μl. Използва се набор от специфични праймери за експресия на металотиоин, както беше споменато по-горе. PCR се извършва, като се използват 25 цикъла, състоящи се от 3 сегмента от 94 ° С за 1 min; 50 ° С за 2 минути; и 72 ° С за 3 минути, и след това окончателно удължаване при 70 ° С за 5 минути. Настройките на температурата, номерът на цикъла и съдържанието на РНК бяха калибрирани и оптимизирани, както беше описано по-рано (Schlenk et al., 1997a).

Клониране и секвениране

Продуктите RT-PCR бяха изолирани от агарозни гелове с помощта на комплекти за екстракция на ДНК Millipore (Millipore, Bedford, МА) и клонирани в pCR-2.1 вектора на ТА системата за клониране (Invitrogen, Carlsbad, CA). ДНК на плазмид се приготвя от 10 получени бактериални колонии с Qiagen Plasmid Mini-prep kit (Qiagen, Валенсия, Калифорния). Наличието на подходящи по размер вложки се потвърждава от рестрикционни ензимни усвоявания с EcoRI (Promega, Madison WI). Шест независимо изолирани клонинги бяха секвенирани с помощта на флуоресцентно маркиран Themo Sequenase комплект за секвениране на праймер цикъл (Amersham Pharmacia Biotech, Inc., Piscataway NJ) и IRD 700, маркирани с T7 или IRD 800, маркирани с M13-обратни секвениращи праймери (LI-COR, Inc., Lincoln NE). Реакциите за секвениране бяха проведени на LI-COR 4200-L2 Sequencer (LI-COR Inc.) и получените изображения бяха анализирани със софтуера на производителя.

Нуклеотидната последователност е концептуално преведена с помощта на програмата ORF Finder, поддържана от уебсайта на Националния център за биотехнологична информация (NCBI) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) и предполагаемия ORF, кодиращ 60-аминокиселинен протеин, представляващ сом MT е идентифициран. Нуклеотидните и аминокиселинните последователности бяха подложени на BLAST търсене на уебсайта на NCBI, за да се идентифицират предварително клонирани, свързани гени и протеини. Получените аминокиселинни последователности на МТ бяха сравнени, използвайки максимално дърво на парсимона, конструирано от алгоритъм за търсене на клонове и ленти, използвайки софтуера PAUP (3.1) (Champaign, IL).

Статистика

Разликите между групите бяха определени чрез еднопосочен ANOVA (α = 0,05), последван от теста на Student-Newman-Kuels или множествения диапазон на Bonferroni за значимост. Разликите, зависими от времето и дозата, бяха едновременно оценени чрез двупосочен ANOVA (Statview 5.1). Корелационният анализ се извършва чрез проста линейна корелация (α = 0,05).

РЕЗУЛТАТИ

464-bp RT-PCR продукт, съдържащ 180-bp отворена рамка за четене, е получен от обработен с кадмий черен черен дроб на сом (Фиг. 1). Отворената рамка за четене кодира 60-аминокиселинен пептид, който е последван от 269-bp участък от последователността надолу по веригата, предшестваща мястото на полиаденилиране. Предварително диктуваната 60 аминокиселинна последователност съдържа 21 цистеинови остатъка в класически C-X-C и CC-XX-CC мотив. Имаше само един метионин, без хистидин и без ароматни аминокиселинни остатъци. Изведената аминокиселинна последователност на сом MT е най-сходна с MTloun (86,7%) и най-малко подобна на тилапия (78,3%) (фиг. 2). Сравненията на ORF нуклеотидни последователности сред телеостните риби също демонстрират, че камбаната има най-голяма хомология на последователността със сом (80,5%). Най-малко хомоложната ORF нуклеотидна последователност е пъстърва А, с хомология от 76,7% и 42 замествания. Уникалните нуклеотиди в MT ORF на сома включват тези на 57, 76, 79, 135, 141, 156, 157 и 173.

След секвениране на MT cDNA, впоследствие тя се използва като сонда за измерване на експресията на MT mRNA в хрилете на животни, третирани с Mn. След лечение с Mn не са наблюдавани значителни промени в експресията на мРНК на хрилни MT до 8 седмици при лечение с концентрация от 2,0 mg/L (Фигури 3 и 4). Освен това не са наблюдавани значими корелации между експресията на MT mRNA в хрилете и растежа, дължината, LSI или CI (данните не са показани).

Не се наблюдава смъртност в нито една от лекуваните групи през 8-те седмици на излагане на Mn. Въпреки че се наблюдават значителни намаления в теглото при мъже, лекувани с 0,5 mg/L PM след 2 седмици и 4 седмици, теглото се връща към контролните стойности и не е свързано с дозата (данните не са показани). Не са наблюдавани значителни разлики или тенденции в дължината след лечение (данните не са показани).

Чернодробните соматични (LSI) и състоянието индекси (CI) са значително повлияни от лечението. CI при мъжете са значително намалени след 4, 6 и 8 седмици лечение с 2,0 mg/L PM (фиг. 5). Намалението обаче не е свързано с времето на експозиция, тъй като не се наблюдават значителни разлики в CI между животните, взети на проби на 4, 6 и 8 седмици. LSI е намален при жени при всички дози след 6 седмици, но след това се възстановява с 8 седмици (фиг. 6). Подобна тенденция се наблюдава при мъжете, където намаляването на LSI се наблюдава след 4 седмици, след което се възстановява до контролни нива след 6 седмици, с изключение на животните от 1,0 mg/L, при които LSI е по-малко от контролите след 8 седмици (Фигура 7).

ДИСКУСИЯ

Тъй като PM е силен окислител, предполагаемата токсичност за рибите ще бъде медиирана чрез неблагоприятно въздействие върху кожата или хрилете (Brouck and Johnson, 1979). За да се оцени сублеталното увреждане на хрилете, експресията на стресовия протеин металотиоин се изследва в хрилете, получени от животни, изложени на PM. При гризачите инжектирането на Mn причинява значителна индукция на чернодробна МТ (Waalkes и Klaassen, 1985), която не се причинява от свързването на Mn с метални регулаторни транскрипционни фактори (Bracken и Klaassen 1987). Въпреки това, при сомове не се наблюдават значителни увеличения в хрилни MT mRNA след 8 седмично излагане на PM. Всъщност се наблюдават значителни намаления в концентрациите от 2,0 mg PM/L. Няколко проучвания демонстрират, че писцин МТ се индуцира от други окислители като водороден прекис (Kling et al., 1996; Schlenk and Rice 1998). Липсата на индукция на MT в хрилете и неуспехът на сома да натрупва Mn в тъканите предполага, че Mn, когато е под формата на калиев перманганат, не се абсорбира лесно и не е бионаличен за сома.

За да се измери експресията на МТ, MT cDNA сонда е изолирана от обработен с кадмий канал черен дроб на сом. Характеристиките на cDNA са показателни за клас I MT последователности (Kagi и Schaffer 1988). Има 4 аминокиселинни остатъка, които са уникални за MT сом в сравнение с други телести (аланин-26; цистеин 27; D-52; K-57). Всички идентифицирани до момента риболовни MT последователности имат запазен брой и позиция на цистеините. Всички рибни МТ имат 60 аминокиселини, с изключение на Пъстърва МТ-А, която има допълнителен аланин в кръстопътя между втория и третия интрон, който установява границата между алфа и бета домейните на протеина,

50% управлявано с мнозинство дърво на консенсус, получено от 21 най-вредни дървета, е в съответствие с по-ранни доклади, показващи силна хомология на последователността на МТ между телеостианските ордени (Olsson 1996) Каналните сомове са класифицирани в семейство Ictaluridae и отреждат Cypriniformes. Само в две дървета на парсимони, сомът MT не се е сблъскал с други киприниди Stoneloach/Goldfish (данните не са показани), образувайки група от зимна камбала, писия, треска, тилапия, Stoneloach и златна рибка.

По-ранни проучвания с третирани с кадмий канални сомове показват две транскрипти на иРНК, които корелират с два MT протеина, пречистени от черния дроб на третираните с кадмий риби (Zhang and Schlenk 1995). Идентифицирането само на един RT-PCR продукт предполага, че в MT mRNA на сом могат да присъстват множество места за снаждане, което позволява да се образуват транскрипти с различна дължина. Наличието на множество изоформи може също да се обясни с посттранслационна модификация (т.е. ацетилиране) на преведения продукт, което е доказано, че се среща в други МТ (Roesijadi 1992). Друга възможност е, че могат да съществуват множество МТ гени. Това обаче изглежда малко вероятно, тъй като първоначалният анализ на Северна използва cDNA сонда от зимна камбала, показваща подобна хомология на последователността (Zhang и Schlenk 1995). Ако в сом присъства друг уникален MT ген, тогава първоначалните 18 нуклеотиди трябва да бъдат драстично различни от всеки друг телеост MT, тъй като хомологията на последователността за първите 6 аминокиселини е толкова силно запазена при рибите (Chan 1994) (Olsson 1996).

В обобщение, оксидантът, калиев перманганат, не е причинил смъртност при сомовете в канала след 8 седмици на периодично излагане. Значителни временни ефекти върху комбинирания растеж, дължина и тегло на черния дроб се наблюдават след 4 седмици на експозиция, но се връщат към изходното ниво до 8 седмици. Не е наблюдавана връзка между оксидант-стрес протеина металотионеин (MT), дозата или каквото и да е измерване на цели животни. За да се извършат МТ измервания, единична кДНК се изолира чрез 3`RACE RT-PCR от третирани с кадмий черен дроб на сом от канал и се характеризира. Структурната идентификация на този продукт потвърждава по-ранни проучвания с използване на RT-PCR за измерване на експресията на МТ в сом след третиране с различни метали.

Подравняване на отворени рамки за четене от кДНК на teleost MT. * Представлява запазване на базата между всички последователности. Номера за присъединяване на последователностите: TroutA 127414; ПъстърваB 127433; Щука 103852; Stoneloach 1346601; Треска 471773; Сом 219393; Писия 345578; Тилапия 1072468; Златна рибка 1072469; и Фландър (Chan et al., 1989).