И Шен

1 Катедра по гериатрия, болница Тонджи, Университет Тонджи, Медицинско училище, Шанхай, Китай

Ян Лю

1 Катедра по гериатрия, болница Тонджи, Университет Тонджи, Медицинско училище, Шанхай, Китай

Шао-Киу Джън

2 Катедра по интервенционална и съдова хирургия, Шанхайска десета болница, Университет Тонджи, Медицинско училище, Шанхай, Китай

Дзян Хан

3 Отдел по обща хирургия, болница Джоупу в района на Пудунг, Шанхай, Китай

Ер-Ли Пей

4 Катедра по обща хирургия, болница Янпу, свързана с Медицинското училище в Шанхай Тонджи, Шанхай, Китай

Джи-Хонг Ли

3 Отделение по обща хирургия, болница Джоупу в района на Пудунг, Шанхай, Китай

Сяо-Юн Сие

2 Катедра по интервенционална и съдова хирургия, Шанхайска десета болница, Университет Тонджи, Медицинско училище, Шанхай, Китай

Zhi-Qiang Li

5 Катедра по неврология, Академия за медицински науки в Шанси, болница Шанси Дай, Тайюан, Шанси, Китай

Мин Луо

1 Катедра по гериатрия, болница Тонджи, Университет Тонджи, Медицинско училище, Шанхай, Китай

Резюме

Заден план

Бариатричните процедури като лигиране на лявата стомашна артерия (LGAL) и гастректомия на ръкавите (SG) се очертават като важни процедури за лечение на болестно затлъстяване. В това проучване сравнихме ефектите на LGAL срещу SG върху индуцирана от затлъстяване мастна тъканна инфилтрация и възпаление при индуцирани от диета затлъстели плъхове.

Материал/методи

Плъховете на Sprague-Dawley (SD) са хранени с високомаслена диета (HFD) в продължение на 16 седмици, за да предизвикат затлъстяване. SG, GLAL или съответните фиктивни операции бяха извършени при анестезирани плъхове. Експресията на възпалителен фактор в серума и епидидималната и ретроперитонеалната мастна тъкан са анализирани 4 седмици след операцията. Инфилтрацията на макрофаги и трансформацията на фенотипа също бяха оценени с Western blot анализ и имунофлуоресценция.

Резултати

Както LGAL, така и SG силно атенюирано натрупване на мазнини с високо съдържание на мазнини (HFD) в ретроперитонеалната и епидидималната тъкан. Експресиите на възпалителни цитокини като фактор на туморна некроза (TNF) -agr;, интерлевкин (IL) -6 и моноцитен хемоаттрактант протеин (MCP) -1 бяха понижени след LGAL и след SG чрез насърчаване на активиране на M2 макрофаги, въпреки продължителната експозиция към HFD. Освен това, както LGAL, така и SG водят до повишена инфилтрация на макрофаги, но не допринасят за трансформация на фенотип на макрофагите в M1.

Заключения

LGAL и SG намаляват натрупването на мазнини, причинено от HFD хранене. Терапиите, предназначени да подобрят възпалителния отговор чрез насърчаване на активирането на М2 макрофаги, могат да бъдат ценни.

Заден план

Затлъстяването, което се характеризира с хронично и нискостепенно възпаление, придружено от инфилтрация на макрофаги в мастната тъкан, в крайна сметка допринася за метаболитна дисфункция като инсулинова резистентност (IR) и захарен диабет тип 2 (T2DM) [1–3]. В резултат на имунни клетки като инфилтрация на макрофаги и натрупване в мастната тъкан, провъзпалителните цитокини са били значително произведени; следователно възниква свързаното със затлъстяването възпаление. Предполага се, че макрофагите имат решаваща роля при възпалението на мастната тъкан, свързано тясно със затлъстяването [4]. Все повече доказателства показват, че активирането на макрофаги допринася за диференциацията в M1- или M2-подобни макрофаги, които показват напълно различни профили на генна експресия. По-рано е демонстрирано, че M1 макрофагите инициират директен възпалителен отговор, произвеждайки проинфламаторни цитокини като фактор на туморна некроза (TNF) -α, интерлевкин (IL) -6, моноцитен хемоаттрактант протеин (MCP) -1 и аргиназа (ARG) 1, и в крайна сметка допринасят за последващото индуциране на инсулинова резистентност [5,6]. Въпреки това, M2 макрофагите, получени от чиста мастна тъкан, се характеризират с повишен CD206, аргиназа-1, MglI и IL-10 и участват в възстановяването или ремоделирането на тъканите [7–9].

Бариатричните процедури, като лигиране на лявата стомашна артерия (LGAL), както и гастректомия на ръкавите (SG), се очертават като важни процедури за лечение на болестно затлъстяване и допринасят за подобрена метаболитна функция и продължителна загуба на тегло [10–12]. SG, като относително по-малко инвазивна бариатрична процедура, която премахва приблизително 80% от стомаха, осигурява ограничителни свойства и значително намалява приема на храна [12,13]. Много доклади разкриват, че LGAL може да регулира телесното тегло при животински модели [14,15]. Въпреки това остава противоречиво дали LGAL и SG водят до сравними нива на загуба на тегло и подобряване на метаболизма. Ефектите на LGAL и SG върху възпалителния отговор, инсулиновата сигнализация и инфилтрацията на макрофаги в мастните тъкани, както и механизмите, които са в основата на загубата на тегло и метаболитните подобрения, все още остават неизвестни. В това проучване сравнихме следоперативни резултати, като загуба на тегло, възпалителни цитокини, инсулинов пътек за сигнализиране на относителния протеин, мастна инфилтрация на макрофаги и трансформация на фенотип, в кохорти от индуцирани от диета затлъстели плъхове, претърпели LGAL и SG.

Материали и методи

Декларация за животните и етиката

Здравите мъжки 8-седмични плъхове Sprague-Dawley (SD) са получени от SLAC Laboratory Animal Co. (Шанхай, Китай) и индивидуално поддържани в помещението за животни при контролиран климат 24-26 ° C и влажност около 55 % при 12-часов цикъл светлина-тъмнина. Мъжките плъхове са разпределени на случаен принцип в контролна група или група с HFD, хранени с контролна диета за гризачи и високомаслена диета за гризачи (60% енергия от мазнини, Research Diets, SLAC Laboratory Animal Co.), съответно. След излагане на диета с високо съдържание на мазнини в продължение на 16 седмици, плъховете в кохортата на HFD бяха разпределени на случаен принцип към групите HFD Sham, HFD L и HFD SG и бяха подложени на съответна операция. Всички плъхове бяха умъртвени 4 седмици след операцията. Всички плъхове бяха третирани в съответствие с Ръководството за грижа и използване на лабораторни животни от Националния здравен институт. Изследването е одобрено от Комитета за грижи и използване на животните на болница Тонджи, а процедурите за животни стриктно следват указанията, предоставени от Комитета по етика на болницата Тонджи.

Хирургични процедури

Плъховете със затлъстяване са гладували вечерта преди операцията. SG, LGAL или съответните фалшиви операции бяха извършени при плъхове, анестезирани с 4% интраперитонеална инжекция със севофлуран, както беше съобщено по-рано. Накратко, за процедурата за SG, приблизително 80% от стомаха са отстранени по протежение на по-голямата кривина от антралната част до очното дъно, както се съобщава по-рано. Процедурата LGAL се състоеше в извършване на 3-сантиметрова ексцизия и лигиране на лявата стомашна артерия, както беше съобщено по-рано. Фиктивната операция се състоеше от 3-сантиметрова ексцизия и излагане на стомаха. След операцията на плъховете веднага се прилагат подкожни инжекции стерилен физиологичен разтвор и се прилага течна диета в продължение на 3 дни.

Анализи на серумен възпалителен фактор

Нивата на серумен TNF-a, IL-6 и MCP-1 бяха измерени с помощта на ензимно-свързан имуносорбентен анализ (ELISA) (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA). Всички процедури бяха извършени в съответствие с инструкциите на производителя.

Количествена PCR в реално време (qPCR)

Общата РНК се извлича от ретроперитонеалната и епидидималната мастна тъкан с реагент TRIzol (Molecular Research Center, Inc., Cincinnati, OH, USA) в съответствие с инструкциите на производителя. CDNA беше получена от обща РНК с използване на обратна транскриптаза на миши левкемичен вирус на Moloney (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA; Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA). Последователностите на праймера, използвани за RT-PCR, бяха за

IL-6, напред: 5′-GGCGGATCGGATGTTGTGAT-3 ′,

TNF-α, напред: 5′-GCGGCCACAGAAAACACTC-3 ′,

MCP-1, напред: 5′-CTGAGTTGACTCCTACTGTGGA-3 ′,

ERK, напред: 5′-ACTGCTGGGCATAACGCTTTT-3 ′,

JNK, напред: 5′-CGCCAGTCGTGGAGGAAAA-3 ′,

NFκB, напред: 5′-ACACCTCTGCATATAGCGGC-3 ′,

бета-актин, напред: 5′-GCCCTGAGGCTCTTTTCCAG-3 ′,

Полуколичествената PCR се извършва със система Applied Biosystems 7300 qPCR (Applied Biosystems; Thermo Fisher Scientific, Inc.) с термоциклиране, както е описано по-горе. Количеството на иРНК се нормализира до GAPDH като вътрешен стандарт.

Уестърн блотинг

Общите протеини бяха извлечени и количествено определени от клетката или от ретроперитонеалната и епидидималната мастна тъкан. След това от всяка проба бяха изолирани 30-50 μg протеин, използвайки 10% SDS-PAGE (гел за подреждане, 50 V; отделящ гел, 100 V) и прехвърлен в нитроцелулозната мембрана (100 V, 75 минути). Мембраните бяха блокирани и инкубирани с първични антитела, последвани от вторични антитела. Вторичните антитела, белязани с пероксидаза от хрян, се откриват чрез хемилуминесценция и скалата на сивото на протеиновите ленти се анализира със софтуер за анализ на изображения Gel-pro (Media Cybernetics, Rockville, MD, USA). Първичните антитела срещу p-IRS (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA), p-Akt (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA) и бета-актин (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA) са използвани в това проучване.

Протокол за маслено червено оцветяване на мастната тъкан

Срезите бяха изсушени и измити с 50% етанол, след това изложени на разтвор на оцветител с маслено червено О в продължение на 8 минути. Диференциацията беше прекратена с 50% етанол и чешмяна вода. Хематоксилин е използван за оцветяване на ядрото, с чешмяна вода обратно към синьо и глицеринов желатинов печат.

Анализ на имунофлуоресценцията

Макрофажни инфилтрации в мастна (зелена) тъкан от ретроперитонеална и епидидимална мастна тъкан бяха открити чрез имунофлуоресценция с F4/80 и DAPI (синьо) оцветяване. F4/80 антитялото е маркер на макрофаги. 4,6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI) се оцветява за клетъчни ядра. Срезите бяха инкубирани с анти-F4/80 антитяло (1: 100; Invitrogen, Карлсбад, Калифорния, САЩ) в продължение на една нощ при 4 ° C и бяха инкубирани с вторично антитяло в продължение на 30 минути, след което бяха заснети изображения.

Статистически анализ

Данните са представени като средно ± SEM. Извършен е двустранният t тест за оценка на различията между групите, използвайки софтуера GraphPad Prism 5.0 (GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA, USA). Стойността на р по-малка от 0,05 се счита за значима.

Резултати

LGAL и SG атенюирано диетично натрупване на мазнини с високо съдържание на мазнини и експресия на възпалителен фактор в ретроперитонеална и епидидимална мазнина

Теглото от ретроперитонеална и епидидимална мазнина нараства значително при индуцирани от диета плъхове със затлъстяване в сравнение с контролната група, докато LGAL и SG намаляват това тегло (Фигура 1А, 1В). Оцветяването с маслено червено допълнително идентифицира, че хирургичното лечение инхибира индуцираното от HFD отлагане на липидни капки в мастните секции (Фигура 1C, 1D).

ефекти

Хирургичното лечение обръща диета с високо съдържание на мазнини (HFD), индуцирана натрупване на мазнини на ретроперитонеална и епидидимална мазнина. Плъховете са били хранени с HFD в продължение на 18 седмици преди лечение с лигация на стомашна лява артерия и гастректомия на ръкава в продължение на 4 седмици. Цялата мастна тъкан от ретроперитонеума и епидидима се отделя и претегля (А, Б). Тегло на цялата мастна тъкан от ретроперитонеума (А) и епидидима (Б.). Данните са представени като средната стойност ± SD. * p # p Фигура 2). При сравняване на лечението с LGAL и SG, намаляването на IL-6 в групата на LGAL е най-очевидно, но експресиите на TNF-α и MCP-1 при лечението с LGAL и SG не се различават значително от тези в групите с HFD. ELISA f показа, че HFD значително индуцира експресия на възпалителен фактор IL-6, TNF-α и MCP-1 в сравнение с нормалната диетична група. Лечението с LGAL и SG също значително потиска индуцирания от HFD повишен възпалителен фактор IL-6, TNF-α и MCP-1 (Фигура 3).

Експресията на възпалителни фактори в ретроперитонеалната и епидидималната мастна тъкан. Плъховете са били хранени с HFD в продължение на 18 седмици преди стомашно лигиране на лявата артерия и гастректомия на ръкава в продължение на 4 седмици. Мастната тъкан от ретроперитонеума и епидидима беше отстранена за Rt-PCR откриване. (A – C) Ниво на експресия на IL-6 (A), TNF-α (Б.) и MCP-1 (° С) от ретроперитонеална мазнина в различни групи. Данните са представени като средната стойност ± SD. *** p ## p ### p # p ## p ### p # p Фигура 4А, 4В). Имунофлуоресцентен анализ с оцветяване с F4/80 показа, че хирургичното лечение насърчава HFD-индуцирана експресия на F4/80. LGAL и SG могат да увеличат инфилтрацията на макрофаги в мастната тъкан от ретроперитонеума (Фигура 4C, 4D). Резултатите показват, че както LGAL, така и SG значително повишават експресията на ARG-1 в иРНК в сравнение с групата с HFD. Експресията на iNOS не се променя в мастната тъкан от епидидима (Фигура 4Е, 4F). Инфилтрацията на макрофаги в епидидималната мастна тъкан също се увеличава след операция, както е показано чрез имунофлуоресцентен анализ за оцветяване с F4/80 (Фигура 4G, 4Н). Взети заедно, резултатите предполагат, че и двете хирургични лечения увеличават инфилтрацията на макрофаги и насърчават активирането на М2 макрофаги.

Ефектът на лигиране на стомашна лява артерия и гастректомия на ръкава върху експресията на p-IRS-1 и p-Akt протеин. (A) Western blot откриването показва експресията на p-IRS-1 и p-Akt в мастната тъкан от ретроперитонеалната тъкан. (Б.) Western blot откриването показва експресията на p-IRS-1 и p-Akt в епидидимална мастна тъкан.

Добре известно е, че инсулинът може да засили периферното усвояване на глюкоза, особено в мастната тъкан, и да ограничи производството на чернодробна глюкоза. След свързването на инсулина с рецепторите на инсулинови клетки, фосфорилирането на остатъци от тирозин върху субстратите на инсулиновите рецептори (IRS) се задейства от тирозин киназа. Фосфорилираният IRS 1 (p-IRS 1) участва в докинг протеини, като по този начин активира сигнални каскади, последвани от Akt фосфорилиране. Глюкозният транспортер тип 4 (GLUT4) се активира чрез Akt фосфорилиране, с последващ синтез на гликоген [17]. Основната ограничаваща скоростта стъпка в усвояването на глюкозата е GLUT-медиираният транспорт на глюкоза [18,19]. GLUT4, който се експресира предимно в мускулните и мастните тъкани, играе ключова роля в хомеостазата на глюкозата. Тези резултати показват, че LGAL и SG подобряват и инсулиновата чувствителност. Доказано е също, че фосфорилирането на IRS и Akt има противовъзпалителен ефект [20].

LGAL и SG намаляват ERK, JNK и NF-kB сигнално-медиирано активиране на възпалителния сигнал

Western blot анализ установи, че HDF насърчава NF-κB, JNK и ERK фосфорилиране в ретроперитонеална и епидидимална мастна тъкан в сравнение с нормалната диетична група. LGAL и SG значително намаляват фосфорилирането на NF-κB, JNK и ERK (Фигура 6). Все повече доказателства показват, че JNK и ERK участват във възпалението. Активирането на JNK и ERK сигнализиране играе важна роля в модулацията на възпалителните реакции и регулирането на фенотипа на макрофагите [20]. Усилвателят на ядрен фактор kappa-лека верига на активирани В клетки (NF-κB) е решаващ транскрипционен фактор, който се активира бързо от различни стимули, увеличавайки експресията на провоспалителни цитокини (напр. MCP-1 и TNF-α) и индуцируем азотен оксид синтаза (iNOS) и той участва в възпалението [21]. Макрофагите участват в индуцирано от затлъстяването възпаление на мастната тъкан. Различни извънклетъчни сигнали стимулират вътреклетъчните пътища и променят секреторния профил на макрофагите, като в крайна сметка допринасят за затихване или увеличаване на възпалението [22]. Това предполага, че LGAL и SG могат да насърчават активирането на М2 макрофаги и да променят секреторния профил чрез регулиране на възпалителната сигнализация.

Ефектът на лигиране на стомашна лява артерия и гастректомия на ръкава върху възпалението и инсулиновата сигнализация, относителна експресия на протеин. (A) Western blot показва експресията на ERK, JNK и NFκB в ретроперитонеална мастна тъкан. (Б.) Western blot откриването показва експресията на ERK, JNK и NF-κB в епидидималната мастна тъкан.

Дискусия

Затлъстяването е свързано с нискостепенно възпаление и инсулинова резистентност и участва в метаболизма на глюкозата и липидите [22]. Последните открития показват, че бариатричната хирургия е най-ефективното средство за лечение на затлъстяване както по мащаб, така и по продължителност на своите ефекти [23,24]. Някои доказателства показват, че LGAL и SG могат да намалят затлъстяването [25,26]. Следователно, настоящото проучване има за цел да идентифицира ефекта на LGAL и SG върху експресията на възпалителни фактори в мастната тъкан. Трябва да изясним ролята на възпалението и инсулиновата резистентност по отношение на молекулярните и клетъчните механизми.

Установихме, че HFD насърчава натрупването на липиди както в ретроперитонеалната, така и в епидидималната мастна тъкан. LGAL и SG обръщат този феномен. Това предполага, че LGAL и SG имат еднакъв ефект на отслабване. SG имаше минимален риск от малабсорбция поради непроменения път на хранителния поток след гастректомия на ръкавите, но в сравнение с SG, LGAL има повече предимства по отношение на намаляването на болката и кървенето. Тези резултати са в съответствие с предишни доклади [27].

По-нататъшни изследвания също установиха, че хирургичното лечение засилва инсулиновата сигнализация чрез инсулинови рецепторни сигнали към PI3K/AKT, която е потисната от HFD индукция. Хирургичното лечение значително намалява фосфорилирането на NFκB, JNK и ERK, което води до намалена експресия на възпалителния ген [32].

Заключения

Нашите данни показват, че както LGAL, така и SG могат да инхибират HFD-индуцирано хронично възпаление в мастната тъкан чрез насърчаване на М2 макрофаги и потискане на противовъзпалителния сигнен път. Нашите резултати също показват, че бариатричната хирургия може да увеличи чувствителността към инсулин. С оглед на безопасността и тежестта на нараняването, LGAL има по-голям потенциал за клинично приложение при загуба на тегло.

Бележки под линия

Източник на подкрепа: Тази работа беше подкрепена от Националната фондация за естествени науки на Китай (грант № 81200244) за Сяо-Юн Сие, Национална фондация за естествени науки на Китай (грант № 81570738) за Сяо-Юн Сие, отдел за наука и технологии на провинция Хунан ( Безвъзмездна финансова помощ 2015JC3130) за Zhi-Hong Li, Бюро за наука и технологии в град Ченжоу (Безвъзмездна помощ CZ2013081) за Zhi-Hong Li, Фонд за развитие на науката в Шанхай Pudong New Area District, (Безвъзмездна помощ PKJ2015-Y39) за Jiang Хан и Фонд за основни строителни дейности на болница Джоупу в района на Шанхай Пудунг (безвъзмездна финансова помощ ZP-xk-2015B-4) на Цзян Хан