1 Институт по неврология, Литовски университет по здравни науки, Каунас, Литва

листа

2 Катедра по биохимия, Медицинска академия, Литовски университет по здравни науки, Каунас, Литва

3 Катедра по протезия, Медицинска академия, Литовски университет по здравни науки, Каунас, Литва

Резюме

Това проучване е предприето, за да се изследват ефектите на екстрактите от листа и цветя на елда върху антиоксидантния статус на мозъка и чернодробната тъкан. Прилагането на екстракти от елда (и двете концентрации са 10%) на мишки (в доза 10 ml/kg телесно тегло) в продължение на 21 дни значително намалява активността на супероксиддисмутаза (SOD) и намалява количеството на глутатион (GSH) и малондиалдехид (MDA) ) в мозъка на мишката, докато активността на каталазата (CAT) значително се повишава. В черния дроб на мишката количеството GSH и активността на SOD се увеличават, докато активността на CAT след прилагане на екстракти от листа от елда и цветя е по-ниска при експериментални мишки, отколкото в контролната група. Прилагането на 10% етанол (в продължение на 21 дни) за контрол на животни също е имало значителен ефект върху антиоксидантната система в мозъчните и чернодробните клетки. Експериментални животни демонстрират доста изразени промени в дейностите на антиоксидантните ензими SOD и CAT в техните чернодробни и мозъчни клетки и се наблюдават промени в нивата на GSH и MDA в сравнение с контролната група.

1. Въведение

Елда (Fagopyrum esculentum Moench) е тревисто растение, което принадлежи към семейство Polygonaceae. Това растение е известно като хранителен източник на протеини с благоприятен аминокиселинен състав, фибри, витамини (В1 и В2), нишесте, основни минерали и микроелементи [1–3]. Зърната и корпусите на елда съдържат биологично активни компоненти, като флавоноиди и флавони, танини, фитостероли и фагопирини. Флавоноидите действат като антиоксиданти, инхибиращи липидната пероксидация и смекчаващи щетите, причинени от реактивни кислородни видове [4, 5]. Редица проучвания показват, че елдата притежава силна антиоксидантна активност, главно поради високото съдържание на рутин [6, 7]. Флавоноидите в елдата намаляват нивата на холестерола в кръвта, като помагат за предотвратяване на високо кръвно налягане. Рутинът, съставен от флавонол кверцетин и дизахарид рутиноза, има противовъзпалителен и хипотензивен ефект. Освен това рутин/кверцетин инхибира окисляването на липопротеините, което предполага, че рутинът намалява риска от артериосклероза [8]. Трябва да се отбележи, че съдържанието на рутин в цветната част е по-високо от това на другите части на елда - листа, семена или корени. Около 10% от рутина (на сухо тегло) се намира в цвете и листа на елда [5].

Настоящото проучване беше планирано да оцени ефектите от екстракти от цветя и листа на елда, както и етанол, използван при производството на екстракти върху антиоксидантната система в чернодробните и мозъчните клетки.

2. Материали и методи

2.1. Обект на изследване
2.2. Приготвяне на растителни проби

Елда Fagopyrum esculentum Екстрактите от листа и цветя на Moench („VB Noja“, с произход от Литва) са използвани от Катедрата по аналитична и токсикологична химия на Литовския университет по здравни науки. Изсушени проби от елда от въздушни части се смилат в лабораторна мелница GM 300 (Retsch, Германия). След това 1 g от получения прах се екстрахира при оптимизирани условия на екстракция с 10 ml 96% етанол в ултразвукова баня в продължение на 15 минути при 45 ° С. След това екстрактът се центрофугира в продължение на 10 минути при 6000 об/мин, което е последвано от събиране на супернатанта. Пробите се филтрират през мембранни филтри (размер на порите 0.22 μм).

Въз основа на данните на нашите доставчици на екстракти от листа от елда и екстракти от цветя [10] и литература [6, 11–14], в екстрактите от листа и цветя от елда са идентифицирани биологично активни съединения. Списъкът на съединенията и техните концентрации е даден в Таблица 1.

2.3. Измерване на количеството GSH в миши органи

Съдържанието на GSH беше оценено по метода, описан от Bernotiene et al. [15]. Отстраненият мозъчен мозък/черен дроб се претегля и хомогенизира в 6 обема (в сравнение с теглото на тъканите) 5% разтвор на трихлороцетна киселина. Хомогенатът се центрофугира при 10 000 х g в продължение на 7 минути, за да се получи GSH-съдържащата супернатанта. GSH се измерва чрез реакция с DTNB (наричан още реагент на Ellman’s или 5,5

-дитиобис (2-нитробензоена киселина)) за образуване на съединение, което поглъща светлина с дължина на вълната 412 nm. Всяка проба кювета съдържа 2 ml 0,6 mM DTNB в 0,2 М натриев фосфат, рН 8,0; 0,2 ml супернатантна фракция; и 0,8 ml от 0,2 М фосфатен буфер до крайния обем от 3 ml. Съдържанието на GSH се изразява като μmol/g от мокрото тегло на тъканта.

2.4. Измерване на количеството MDA в миши органи

Крайният продукт на липидната пероксидация, MDA, образува комплекс с TBA (тиобарбитурова киселина) и съдържанието му може да бъде определено спектрофотометрично; резултатите се изразяват като nmol/g от мокрото тегло на тъканта [15]. Мозъкът/черният дроб се отстраняват и хомогенизират с 9 обема (в сравнение с теглото на тъканите) студено 1,15% KCl, за да се получат 10% хомогенат. Впоследствие към 0,5 ml от този хомогенат се добавят 3 ml 1% H3PO4 и 1 ml 0,6% TBA воден разтвор. Сместа се нагрява в продължение на 45 минути във вряща водна баня. След охлаждане се добавят 4 ml н-бутанол и получената смес се разбърква енергично. Бутаноловата фаза се разделя чрез центрофугиране и се определя абсорбцията на супернатанта при 535 и 520 nm дължини на вълната.

2.5. CAT Анализ на активността

CAT активността в мозъчни и чернодробни хомогенати се определя съгласно метода, описан от Sadauskiene et al. [16]. Методът се основава на разграждането на водороден прекис (H2O2) от CAT. Реакционната смес е съставена от 50 mM Tris-HCl буфер с рН 7,4 с 18 mM H2O2 (смес буфер-субстрат) и 100 μL на органа хомогенат. Реакционната смес се инкубира при 37 ° С в продължение на 180 s. Ензимната реакция се спира с 2,0 ml 4,5% амониев молибдат и се измерва абсорбцията на жълтия комплекс от молибдат и водороден пероксид при дължина на вълната 410 nm срещу празна проба (буфер-субстратна смес, инкубирана в продължение на 180 s с добавени амониев молибдат и 100 μL на хомогената). Резултатите са изразени в U/mg протеин. Една единица каталаза (U) се разлага 1 μmol водороден прекис за 1 min при тези условия.

2.6. Анализ на активността на SOD

Активността на супероксиддисмутазата в мозъчния хомогенат се оценява съгласно метода, описан от Rachmanova et al. [17]. Спектрофотометричната оценка на активността на SOD се основава на инхибирането на скоростта на редукция на нитроблуев тетразолий (4-нитроблуев тетразолиев хлорид, NBT) в неензимната феназин метосулфат-никотинамид аденин динуклеотидна система. Първо приготвихме реакционна смес, състояща се от 0,1 М фосфатен буфер (рН 7,8), 0,41 тМ NBT, 0,33 тМ EDTA (етилендиаминтетраоцетна киселина), 0,01 тМ ПМС (феназин метосулфат) и 0,8 тМ NADH. За започване на реакцията към тази смес се добавя избрано количество от мозъчния хомогенат. Използва се спектрофотометър за измерване на оптичната плътност при 540 nm—

(първоначално изчезване). След 5 минути отново беше измерена оптичната плътност - ECB (екстинкция след 5 минути). Активността на SOD се изразява като U/mg протеин, където U е относителна единица активност, определена като количеството SOD, необходимо за инхибиране на намаляването на NBT с 50% и изразена като единица активност в проба от 1 mg протеин.

2.7. Тест за концентрация на протеин

Концентрацията на протеин в хомогенатни проби от мозъка и черния дроб беше измерена по метода на Варбург-Кристиан.

2.8. Статистически анализ

Данните бяха изразени като средна стойност ± SEM (стандартна грешка на средната стойност). Статистическата значимост беше оценена с помощта на еднопосочен дисперсионен анализ (ANOVA) и несдвоения студент

-тест. Стойността на

се счита за статистически значима (SPSS версия 19.0, SPSS).

3. Резултати

Данните за активността на CAT и SOD в тъканите на контролни и опитни животни са дадени на фигури 1–4. CAT активността в мозъка на мишки при добавяне на етанол (контрола 2) е значително по-голяма от тази на контролните мишки (контрола 1). При животни, лекувани с екстракти от елда от листа и цветя, активността на CAT в мозъка също е по-висока от тази в контролната 1 група (Фигура 1). Междувременно активността на CAT в черния дроб на мишки, които са получавали етанол (контрол 2) и екстракт от цветя от елда, е значително по-ниска от тази на животните от контрола 1 (Фигура 2). Само екстрактът от листа от елда не причинява промени в активността на CAT в черния дроб в сравнение с контролната група 1.


, в сравнение с контролната 1 група.


, в сравнение с контролната 1 група.


, в сравнение с контролната 1група.


, в сравнение с контролната 1 група.

Активността на SOD в мозъка на мишки, получили етанол (контрола 2) и екстракти от листа от елда и цветя, е значително по-ниска от тази в контролната група 1 (Фигура 3). Междувременно тази активност в черния дроб на мишки, лекувани с изследваните екстракти, беше значително увеличена (Фигура 4). В този случай обаче активността на SOD в контролната 2 група е същата като тази в контролната 1 група.

В по-нататъшни експерименти ние оценихме ефектите от екстракти от елда от листа и цветя върху намаляването на концентрацията на GSH и MDA в мозъка и черния дроб на експериментални мишки. Концентрациите на GSH и MDA в тъканите при контролни и опитни животни са дадени в таблица 2.

GSH (μmol/g тъкан)MDA (nmol/g тъкан)
ГрупиМозъкЧерен дробМозъкЧерен дроб
Контрол 12,4 ± 0,064,5 ± 0,35106 ± 2,3571 ± 2,98
Контрол 21,18 ± 0,02

, в сравнение с контролната 1 група.

Получените резултати показват, че концентрацията на GSH е значително по-ниска в мозъка на мишки, получавали екстракти от елда. Концентрацията на GSH в мозъка също е била по-ниска при мишки, на които е прилаган само етанолов разтвор (контрола 2). Въпреки това, концентрацията на GSH в черния дроб на експериментални мишки е по-висока в сравнение с тази на контролни мишки 1. Нивото на MDA в мозъка на експерименталните животни е по-ниско от това на контролната 1група. Въпреки това, нивото на MDA в черния дроб не се променя при мишки, третирани с екстракти от елда от листа и цветя, в сравнение с контролите (контрола 1). Междувременно в черния дроб на мишки, които са получавали само етанол (контрола 2), нивото на MDA е значително по-високо от това в контролната група 1.

4. Дискусия

4.1. Ефектът от екстракти от елда от цветя и листа върху активността на SOD и CAT в мозъка и черния дроб на мишката

SOD и CAT се наричат ​​„първата линия на защита“ в антиоксидантната система. Това са ензимите, които се намират в почти всички живи организми, изложени на кислород. SOD е ензим, който алтернативно катализира дисмутацията на супероксидния радикал (O - 2) в молекулярен кислород или водороден пероксид (H2O2), докато CAT катализира разграждането на водородния пероксид във вода и кислород [24]. И двата ензима са изключително важни за защита на клетките на тялото от окислително увреждане, причинено от реактивни видове кислород [25]. От друга страна, и двата ензима от клетъчната антиоксидантна система са сред най-важните биомаркери на оксидативен стрес. Поради тази причина, за да определим състоянието на антиоксидантната система в мозъчните и чернодробните клетки след третирането на мишки с екстракти от цветя и листа на елда, решихме да оценим SOD и CAT дейностите в мозъчните и чернодробните хомогенати на мишки.

Също така оценихме промените в активността на друг ензим от антиоксидантната система, CAT, при същите експериментални условия. Резултатите от оценката показват, че във всички случаи активността на CAT в мозъка на мишката се е увеличила значително в сравнение с контролни 1 мишки (22,88 ± 1,98 U/mg протеин). По този начин, активността на CAT в мозъка на мишки, на които е прилаган BL, се е увеличила до 201% (68,97 ± 12,32 U/mg протеин), а при мишки, които са получили BF до 126% (51,77 ± 7,90 U/mg протеин). Много подобно увеличение на активността на CAT (186%, 65,51 ± 10,58 U/mg протеин) се наблюдава и в мозъка на мишки, които са получавали само етанолов разтвор. Междувременно в черния дроб на експериментални мишки се наблюдават напълно различни промени в активността на CAT. Тук, в отделни случаи, активността на CAT имаше тенденция да намалява (статистически надеждно). По този начин, активността на CAT в черния дроб на мишки, на които е прилаган BF, е 669.50 ± 36.95 U/mg протеин, т.е. по-ниска (-21%) от нормата (851.08 ± 5.74), докато при мишки, получили етанолов разтвор, намаляването в активността на ензима е 28% (613,59 ± 41,33 U/mg протеин). В нашето проучване само BL няма ефект върху активността на CAT, което е 811,77 ± 17,95 U/mg протеин.

Бихме искали да отбележим факта, че промените в активността на CAT под въздействието на екстракт от листа от елда и разтвор на етанол се различават коренно в различните органи (в този случай в мозъка и черния дроб). Освен това от особено значение е фактът, че в клетките на едни и същи органи ензимите от практически една и съща линия, SOD и CAT, демонстрират напълно различни тенденции на промени в активността. Например, докато активността на SOD в мозъка на мишката очевидно намалява под въздействието на експерименталните препарати (включително разтвора на етанол в контролни 2 мишки), активността на CAT се увеличава. Същата картина се наблюдава в черния дроб на опитни мишки, само в този случай ситуацията е противоположна: докато активността на SOD се увеличава, активността на CAT намалява. В случая на черния дроб трябва да се отбележат две изключения: приложението на етанолов разтвор не е оказало ефект върху активността на SOD, докато активността на CAT почти не се е повлияла от прилагането на екстракт от цветя на елда.

4.2. Ефектът от екстракти от елда от цветя и листа върху количеството GSH и MDA в мозъка и черния дроб на мишките

Заедно с оценката на нивата на GSH, ние оценихме промените в нивото на MDA в мозъка и черния дроб на експериментални мишки. MDA е известен като краен продукт на липидно пероксидация и се счита за важен маркер на окислителния процес в телесните клетки. Нашите резултати показват, че в мозъка на мишки, които са получавали BL и BF в продължение на 21 дни, нивата на MDA са намалявали статистически надеждно в сравнение с мишките от контролната 1 група. В мозъка на мишки, на които е прилаган BL, нивата на MDA спадат с 32%, докато в мозъка на мишки, получили BF, те намаляват с 50%. Забележително е, че нивата на MDA също очевидно са намалели (-52%) в мозъка на мишки от контролната група 2, т.е. тези, които са получавали само разтвор на етанол. Междувременно нивата на MDA в черния дроб на мишки, получили BL и BF, остават практически непроменени, в сравнение с контролни 1 мишки. Въпреки това, нивата на MDA в черния дроб на контролни 2 мишки (тези, които са получили само алкохолен разтвор) статистически надеждно се увеличават с 22% след 21 дни от започването на експеримента.

Така, като цяло, резултатите, получени по време на нашия експеримент, показват, че BL и BF препаратите влияят на редокс състоянието на клетките на миши орган (мозък и черен дроб). След 21 дни от експеримента наблюдавахме ясна тенденция, показваща, че изследваните препарати инхибират активността на ензима SOD и намаляват количествата GSH и MDA в мозъчните клетки на мишки. Този ефект на препаратите от елда е споменат и в литературата [27]. Резултатите от нашето проучване обаче показват, че прилагането на етанолов разтвор (основата на екстрактите) върху мишки има практически същия ефект. Докато данните за инхибиране на активността на SOD и намаляване на нивата на GSH под въздействието на алкохол могат да бъдат намерени в литературата [28, 29], намаляването на нивата на MDA, наблюдавано по време на нашия експеримент, изглежда противоречи на литературните данни. В допълнение, промените в активността на CAT в мозъка на мишката също противоречат на общата тенденция. Активността на този ензим значително се е увеличила във всички експериментални групи.

Противоположни промени се наблюдават в черния дроб на опитни животни. Тук активността на SOD и нивата на GSH се увеличиха, докато нивата на MDA останаха практически непроменени (с изключение на контролната група 2, където те се увеличиха с 22% в сравнение с контролната група 1). В черния дроб, както и в мозъка, ензимът CAT демонстрира противоположни тенденции - неговата активност намалява (с изключение на групата животни, получили BL): в групата на BF тя намалява с 21%, а в контролната група 2 с 28%.

Трябва обаче да се вземат предвид резултатите, получени само с разтвор на етанол (контролна група 2). На практика във всички случаи този разтвор повлиява активността на изследваните ензими (SOD и CAT) и концентрациите на GSH и MDA в мозъчните и чернодробните клетки на експериментални мишки; в повечето случаи ефектът на този реагент е сравним с този на BL и BF. Това показва, че механизмът на действие на ботаническите екстракти върху окислителната система на органните клетки може да бъде не само този на биологично активните вещества в екстрактите (в случая BL и BF), но и на основата на екстракта, етанол. По този начин, по-нататъшните проучвания в тази област трябва да вземат предвид ефекта на отделните компоненти на екстракта, особено етанола, върху жизнените процеси в клетките на органите.

5. Заключения

Нашето проучване разкри, че многократното прилагане на екстракти от цветя и листа на елда оказва влияние върху ензимната активност на супероксиддисмутазата и каталазата в мозъка и черния дроб на мишките. Установено е и стимулиращо въздействие на етанола върху дейностите на двата ензима в органите на експерименталните мишки.

Наличност на данни

Данните, използвани в подкрепа на констатациите от това проучване, са достъпни от съответния автор при поискване.

Конфликт на интереси

Авторите на това проучване заявяват, че нямат конфликт на интереси.

Благодарности

Авторите на тази статия благодарят на ръководителя на Катедрата по аналитична и токсикологична химия на Литовския университет по здравни науки професор Лиудас Иванаускас за предоставените екстракти от цветя и листа от елда, използвани в това проучване.

Препратки