Seog-Young Kim

Mak-Soon Lee

Юджийн Чанг

Sunyoon Jung

Хюнми Ко

Eunyoung Lee

Сооджин Лий

Чонг-Тай Ким

Ин-Хван Ким

3 Катедра по интегрирани биомедицински и биологични науки, Корейски университет, Сеул 02841, Корея; rk.ca.aerok@ni016k

екстрактът

Янха Ким

Свързани данни

Резюме

1. Въведение

Затлъстяването се отнася до прекомерно натрупване на мазнини в мастната тъкан поради хроничен положителен енергиен баланс [1]. Състоянието на затлъстяване може да играе роля в възпалителния отговор, придружен от метаболитни заболявания като диабет и сърдечно-съдови заболявания. Доказано е, че увеличаването на натрупването на мазнини допринася за възпалителния механизъм, с промени в секрецията на провъзпалителни цитокини [2,3,4].

Цитокините се секретират от макрофага на мастната тъкан (ATM), който класически включва две различни форми: провъзпалителен макрофаг M1 и противовъзпалителен макрофаг M2. Банкоматите са склонни да се променят от М2 на М1 по време на прогресията на мастната хипертрофия и впоследствие освобождават провъзпалителни цитокини като фактор на туморна некроза-α (TNF-α), интерлевкин 6 (IL-6) и моноцитен хемоаттрактант протеин 1 (MCP -1) [5,6]. Такава трансформация на макрофагите, пребиваващи в мастната тъкан, се нарича поляризация на макрофагите.

В среда, претоварена с хранителни вещества, дисрегулацията на митохондриалната биогенеза и дисфункционалните митохондрии могат да доведат до непълно окисление на митохондриалните мастни киселини, повишено генериране на реактивни кислородни видове (ROS) и нарушен метаболизъм на глюкозата и инсулинова резистентност [7,8,9]. Те се подкрепят от многобройни клинични проучвания, показващи намалена активност на ензимите, биомаркери на мускулно митохондриално съдържание и митохондриално число в затлъстелите човешки скелетни мускули [10,11,12]. Като се има предвид положителната връзка между затлъстяването и митохондриалната дисфункция на скелетните мускули, е необходимо да се предотвратят индуцираните от затлъстяването митохондриални промени в скелетните мускули.

Елдата произхожда от провинция Юнам в югозападен Китай и се консумира широко като брашно или чай в много страни [13]. Елдата съдържа много биоактивни компоненти и е богата на флавоноиди, включително ориентин, витексун, кверцетин и рутин. По-специално, за тартарната елда (Fagopyrum tataricum) е известно, че има около 80 пъти по-висок рутин от обикновената елда (Fagopyrum esculentum) [14]. От това отношение биологично активните функции на тартарната елда като антиоксидация, хипохолестеролемия и противовъзпаление бяха широко проучени. Етаноловият екстракт от тартарна кълна от елда потиска производството на възпалителен медиатор чрез инхибиране на транслокацията на NF-κB p65 в LPS-стимулирани Raw 264.7 клетки [15]. В 3T3-L1 клетките татарен екстракт от елда етанол също отслабва възпалителния отговор с модулираща продукция на азотен оксид (NO) и генна експресия на TNF-α и IL-6 [16]. Следователно, това проучване изследва ефектите на екстракта от елда от тартар (TB) върху регулацията на адипогенезата и възпалението и митохондриалната биогенеза на мускулите при модел на затлъстели плъхове, индуциран с високо съдържание на мазнини (HFD).

2. Материали и методи

2.1. Приготвяне на тартарни екстракти от елда

TB е любезно доставен от SKBioland Co. (Ansan, Gyeonggi, Корея). Екстракцията се извършва, както е описано по-рано [16]. Накратко, туберкулозата се екстрахира със 70% етанол (1:15 (w/v)) при 80 ° С в продължение на 3 часа и след това се филтрува. Филтратът се изпарява под вакуум и концентрираната течност се изсушава чрез пулверизиране под формата на прах (Dongjin ENG Inc., Siheung, Корея).

2.2. Общо фенолно, общо флавоноидно и рутиново определяне

Общото съдържание на феноли се определя по метода на Folin-Denis [17]. Накратко, 1 ml TB се смесва с 0,5 ml 2 N реагент на Folin-Ciocalteau (Корейски стандарти за хранителни стандарти Codex, 2011) и 2 ml 10% натриев карбонат. Смесеният разтвор се поставя в тъмна стая в продължение на 90 минути при стайна температура и след това абсорбцията се измерва при 765 nm в спектрофотометър (V-550, Jasco, Tokyo, Japan). Данните се изчисляват с галова киселина (GAE) като стандарт и се изразяват в mg еквиваленти на GAE на 1 g сухо тегло.

Общите флавоноиди се определят по метода на алуминиев хлорид [18]. Общо 0,5 ml тартарен екстракт от елда се смесва с 0,5 ml алуминиев хлорид (AlCI3) и се инкубира в продължение на 1 час при стайна температура. Абсорбцията е измерена при 420 nm в спектрофотометър (V-550, Jasco, Токио, Япония). Концентрацията на общия флавоноид се определя със стандартна крива на кверцетин и се изразява като mg еквиваленти на кверцетин на 1 g сухо тегло.

Съдържанието на рутин в туберкулозата се анализира с високоефективна течна хроматография (HPLC) и се определя с рутинов стандарт, както е описано по-горе [16].

2.3. Животни и експериментален дизайн

маса 1

Съставите от експериментални диети (g/kg диета).

КомпонентHFDTB-LTB-H
Казеин238,79238,79238,79
Царевично нишесте185.11180.11175.11
Декстроза157.60157.60157.60
Захароза59,7059,7059,70
Целулоза59,7059,7059,70
Соево масло29,8529,8529,85
Свинска мас208,94208,94208,94
трет-бутилхидрохинон (TBHQ)0,020,020,02
Минерален микс 1 41,7941,7941,79
Витаминен микс 2 11.9411.9411.94
L-цистин3.583.583.58
Холин битартрат2.982.982.98
TB 3 -5.0010.00
Обща сума100010001000
Енергийна плътност (kcal/g)4.84.84.8
Въглехидрати% (калории)353535
Мазнини% (калории)454545
Протеин% (калории)20.20.20.

1 AIN-93G Минерален микс; 2 AIN 93G витаминен микс; 3 TB, съкращение на тартарен екстракт от елда. HFD: 45% диета с високо съдържание на мазнини; TB-L: HFD + 0,5% TB; TB-H: HFD + 1,0% TB.

2.4. Химично измерване на серума

Серумните нива на аспартат трансаминаза (AST), аланин трансаминаза (ALT), триглицериди (TG), общ холестерол (TC) и липопротеинов холестерол с висока плътност (HDL-C) са измервани с ензимни колориметрични методи с помощта на търговски комплекти (Asan Pharmaceutical Co ., Ltd., Сеул, Корея). Липопротеиновият холестерол с ниска плътност (LDL-C) се изчислява по формулата на Friedewald: [LDL-C = TC - HDL-C - (TG/5)] [19].

2.5. Хистологичен анализ на мастната тъкан

WID на епидидима се фиксира с 10-кратен обем от 10% формалин за една нощ. След фиксирането тъканите бяха вградени в парафин и разрязани и оцветени с хематоксилин и еозин (H&E) с помощта на търговски комплект за оцветяване (ScyTek Laboratories, Logan, UT, USA). Пробите са наблюдавани под микроскоп (Олимп, Токио, Япония) и са заловени при увеличение 200 пъти.

2.6. Имунохистохимия на мастната тъкан

Хистологичните срези бяха обработени, както е описано по-горе, депарафинизирани и рехидратирани. Разрезите на тъканите се инкубират с заешки поликлонален анти-F4/80 (EGF-подобен модул, съдържащ муцин, подобен на хормон рецептор 1) (C2C3) разтвор на антитяло (GeneTex Inc., СА, САЩ), последван от разтвор от комплектът за откриване на DAB на Polink-2 Plus HRP срещу плъхове (Golden Bridge International Inc. Irvine, CA, USA). Срезите бяха оцветени с диаминобензидин (Golden Bridge International, Inc.) и оцветени с Mayer хематоксилин (ScyTek).

2.7. Количествена полимеразна верижна реакция в реално време (RT-qPCR)

Общата РНК беше изолирана от епидидимална WAT или скелетна мускулатура, използвайки Ribo Ex (Geneall Biotechnology Co., Ltd., Daejeon, Korea). CDNA се синтезира от 4 μg обща РНК, използвайки M-MLV обратна транскриптаза (Bioneer Co., Daejeon, Корея). Флуорометричен термичен циклер (Rotor Gene ™ 2000; Corbett Research, Mortlake, NSW, Австралия) и AccuPower 2X Greenstar qPCR Master mix (-ROX Dye) (Bioneer Co.) бяха използвани за qPCR анализ в реално време и данните бяха сравнително количествено използвани методът ΔΔCt [20]. Глицералдехид 3-фосфат дехидрогеназата (GAPDH) се използва като референтен ген за нормализиране и резултатите се изразяват като кратна разлика в сравнение с групата с HFD. Грундовете, използвани в настоящото проучване, са описани в допълнителна таблица S1.

2.8. Измерване на серумен TNF-α

Концентрацията на серумен TNF-a беше измерена, като се използва TNF-α на ELISA MAX ™ Deluxe от плъх (BioLegend, Inc., Сан Диего, Калифорния, САЩ), съгласно инструкциите на производителя. Серумната TNF-α молекулна плътност се изразява като мярка за реагиралия с ензими пропорция на цвета. Абсорбцията на пробите беше отчетена с помощта на четец за микроплаки при 450 nm. Чувствителността на комплекта е 2 pg/mL

2.9. Измерване на производството на азотен оксид (NO)

Производството на NO не се измерва като серумен нитрит с помощта на търговски комплект (комплект реактив на Griess за определяне на нитрати; Thermo Scientific, Питсбърг, Пенсилвания, САЩ). Освобождаването на NO в серума реагира с реагента, предоставен от комплекта, за 30 минути и абсорбцията се измерва при 548 nm. Концентрацията на нитрит се определя като се използва натриев нитрит като стандарт. Стойностите бяха представени като разлика в пъти в сравнение със стойностите от HFD групата.

2.10. Анализ на активността на глицерол-3-фосфат дехидрогеназа (GPDH)

Активността на GPDH се измерва чрез използване на комплект за анализ на GPDH (Takara, Япония) в WAT. Пробата, използвана за този анализ, се получава чрез хомогенизиране на 0,1 g WAT с 200 μL ензимен буфер за екстракция. Следва се процедурата за анализ, предоставена от производителя. Резултатите бяха нормализирани до общата концентрация на протеин, която беше определена с комплект за анализ на протеин на бицинхонинова киселина (BCA) (Thermo Scientific). Нормализираната активност на GPDH беше представена като разлика в сгъване в сравнение със стойностите от групата HFD.

2.11. Активни вещества на сиртулин (SIRT) и AMP-активирана протеин киназа (AMPK)

Ензимната активност на SIRT в извлечени мускулни ядрени протеини беше измерена с помощта на колориметричен универсален комплект за анализ на активността на SIRT в съответствие с инструкциите на производителя (Abcam, Cambridge, MA, USA). Накратко, ядрената фракция от скелетните мускули (biceps femoris) беше извлечена и пречистена с помощта на комплект за ядрена екстракция (Abcam). Активността на SIRT се измерва чрез директно откриване на конвертирани с SIRT деацетилирани продукти и се нормализира до съответните им протеинови концентрации, определени чрез BCA комплект за анализ на протеини (Thermo Scientific).

Активността на AMPK се оценява, като се използва метод на полуколичествен имуноанализ на един сайт - комплект за анализ на AMPK киназа (MBL Life Science, Woburn, MA, USA), следвайки инструкциите на производителя. Що се отнася до подготовката на пробата, накратко, 0,1 g епидидимен WAT се хомогенизира в 400 μL RIPA буфер (ELPIS Biotech, Корея). След 10 минути инкубация върху лед, разтворът се центрофугира (4 ° С, 11 463 х g, 20 минути) и водната фаза се отделя. Резултатите бяха нормализирани до количеството протеин, определено с BCA комплект за анализ на протеин (Thermo Scientific). Активността на AMPK се нормализира до концентрацията на протеин и се изразява като кратна разлика в сравнение със стойностите от HFD групата.

2.12. Статистически анализ

Таблица 2

Биоактивни съединения, открити в тартарни екстракти от елда.

Съдържание Екстракт от елда от тартария
Общо феноли (mg GAE/g изсушена проба)101,11 ± 5,5
Общ флавоноид (mg QE/g изсушена проба)95,05 ± 3,6
Рутин (mg/g изсушена проба)106,02 ± 1,3

Данните са изразени като средна стойност ± SEM. Общото съдържание на феноли се изразява в mg еквиваленти на галова киселина (GAE) на 1 g сухо тегло. Концентрациите на общите феноли, общия флавоноид и рутин се изразяват като mg галова киселина (GAE), кверцетин (QE) и еквиваленти на рутин на 1 g сухо тегло.