Фармакологичен отдел, Медицински колеж, университет Chung-Ang, Heuksuk-dong, Dongjak-gu, Сеул, Република Корея

фосфатидилхолинът

Фармакологичен отдел, Медицински колеж, университет Chung-Ang, Heuksuk-dong, Dongjak-gu, Сеул, Република Корея

Фармакологичен отдел, Медицински колеж, Университет Чунг-Анг, Heuksuk-dong, Dongjak-gu, Сеул, Република Корея

Фармакологичен отдел, Медицински колеж, университет Chung-Ang, Heuksuk-dong, Dongjak-gu, Сеул, Република Корея

Роли Формален анализ

Фармакологичен отдел, Фармацевтичен колеж, Католически университет в Тегу, Кьонсан, Република Корея

Роли Формален анализ

Отделение за физическа терапия, Колеж по здравни науки, Корейски университет, Сеул, Република Корея

Роли Формален анализ

Катедра по фармация и биотехнологии, Университет Конянг, Daejeon, Република Корея

Писане на роли - оригинален проект, писане - преглед и редактиране

Катедра по фармакология, Факултет по ветеринарна медицина, Университет Кайро, Гиза, Египет, Катедра по медицинска фармакология, Медицински факултет, Университет Ататюрк, Ерзурум, Турция

Фармакологичен отдел, Медицински колеж, университет Chung-Ang, Heuksuk-dong, Dongjak-gu, Сеул, Република Корея

Програма за невропсихофармакология и токсикология, Фармацевтичен колеж, Национален университет Kangwon, Chunchon, Република Корея

Фармакологичен отдел, Медицински колеж, университет Chung-Ang, Heuksuk-dong, Dongjak-gu, Сеул, Република Корея

Роли Концептуализация, писане - оригинален проект, писане - преглед и редактиране

Фармакологичен отдел, Медицински колеж, университет Chung-Ang, Heuksuk-dong, Dongjak-gu, Сеул, Република Корея

  • Tae Woo Jung,
  • Парк Taekwang,
  • Парк Jinwoo,
  • Уисеок Ким,
  • Хюн Донг Дже,
  • Хьонг-Донг Ким,
  • Seong-Wan Cho,
  • А. М. Абд Ел-Ати,
  • Песен Джин-Хо,
  • Хюнг-Чун Ким

Фигури

Резюме

Цитат: Jung TW, Park T, Park J, Kim U, Je HD, Kim H-D, et al. (2019) Фосфатидилхолинът причинява адипоцитно-специфична липолиза и апоптоза в мастните и мускулните тъкани. PLoS ONE 14 (4): e0214760. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0214760

Редактор: Макото Канзаки, Университет Тохоку, ЯПОНИЯ

Получено: 27 декември 2018 г .; Прието: 19 март 2019 г .; Публикувано: 8 април 2019 г.

Наличност на данни: Всички съответни данни се намират в ръкописа и в неговите поддържащи информационни файлове.

Финансиране: Това проучване беше подкрепено с безвъзмездни средства, предоставени на авторите (TWJ: 2016R1C1B2012674; JHJ: 2017R1D1A1B03028892) от Националната изследователска фондация на Корея (NRF), https://www.nrf.re.kr/index. Финансистите не играят никаква роля в дизайна на проучването, събирането и анализа на данни, решението за публикуване или подготовката на ръкописа.

Конкуриращи се интереси: Авторите са декларирали, че не съществуват конкуриращи се интереси.

Съкращения: PPC, фосфатидилхолин; siRNA, малка интерферираща РНК; TNFα, туморен фактор некроза алфа; IL-1β, Интерлевкин 1 бета

Въведение

Мезотерапията е нехирургична, минимално инвазивна техника за доставяне на лекарства в мезодермата за лечение на локални региони [1]. Основната функция на тази система е да увеличи дозата на лекарството и проявява силни терапевтични ефекти върху много недъзи, като мастна емболия, хиперлипидемия, локална болка и чернодробни проблеми [2]. Фосфатидилхолинът (PPC) е фосфолипид, получен от лецитин, естествено открит в яйчен жълтък, соя и мляко [3]. Този компонент потиска натрупването на липиди и облекчава чернодробните нарушения, резултат от натрупване на чернодробни липиди, миокардна исхемия и деменция [3–5]. Понастоящем формула, базирана на PPC, се използва за лечение на локално натрупване на липиди чрез регулиране на липолизата на мазнините [6]. Освен това размерът на липома се намалява след интралезионно инжектиране на PPC [7].

Жлъчните соли, като натриев дезоксихолат (SD), са били използвани за подобряване на хидрофилността на PPC [8], преди да бъдат използвани в отворени клинични изпитвания [9]. Алтернатива на липосукцията, PPC-базирана формулировка е използвана за намаляване на частичната мастна тъкан като нехирургичен метод [10]. Преди това няколко проучвания демонстрираха, че подкожното инжектиране на базирана на PPC формула може да доведе до разтваряне на мазнини [11, 12]. Въпреки това, поради своите повърхностноактивни характеристики, SD причинява силна болка (чрез некроза и възпаление) и стимулира разграждането на мазнините по неспецифичен начин [13]. В нашето предишно проучване ние докладвахме ефекта на PPC-базирана формулировка без SD заедно с липолитичната му активност в 3T3-L1 адипоцити чрез TNFα-медииран път [14]. Трябва да се отбележи, че селективността на PPC-базирана формулировка без SD към различни клетъчни типове остава неясна, въпреки че беше разкрито, че формула, съдържаща PPC, засяга специално адипоцитите и има по-малък ефект върху жизнеспособността на преадипоцитите [15].

Взети заедно, настоящото проучване е предназначено да изясни ефектите на формула, съдържаща PPC без SD върху експресията на липолитични цитокини, включително тумор некротизиращ фактор алфа (TNFα), интерлевкин 1 бета (IL-1β) и интерферон гама (IFNγ), и апоптоза в различни клетъчни типове (адипоцити, миоцити, съдов ендотел и фибробластни клетки). По-нататък изследвахме ролята на TNFα и IL-1β в PPC-медиираната липолиза и апоптоза в адипоцитите.

Материали и методи

Клетъчни култури и реактиви

Western blot анализ и антитела

Протеини от 3T3-L1 адипоцити се екстрахират с лизисен буфер (PRO-PREP; Intron Biotechnology, Сеул, Република Корея) в продължение на 90 минути при 4 ° С. Протеинови проби (30 μg) бяха заредени на 10% SDS-PAGE, прехвърлени в нитроцелулозна мембрана (Amersham Bioscience, Westborough, MA, USA) и изследвани с първично антитяло, последвано от вторично антитяло, конюгирано с пероксидаза от хрян (Santa Cruz Biotechnology) . Пробите бяха открити с комплекти за подобрена хемолуминесценция (ECL) [14, 16]. Анти-TNFα (1: 1000), анти-IL-1β (1: 1000), анти-NFκB (1: 1000) и анти-β-актин (1: 3000) (Santa Cruz Biotechnology, Санта Круз, Калифорния, САЩ).

Обща екстракция на РНК и количествена PCR в реално време

MTT анализ

3- (4,5-диметилтиазолил-2) -2,5-дифенилтетразолиев бромид (MTT) се разтваря във фосфатно буфериран физиологичен разтвор (PBS; Invitrogen), за да се получи работен разтвор от 2 mg/ml; 100 μL MTT се добавят към всяка ямка. Клетките се инкубират при 37 ° С, 5% СО2, 95% въздух и 100% влажност. След 3 часа разтворът на МТТ се замества със 100 μL DMSO. За цялостно смесване плаките се инкубират при стайна температура в продължение на 10 минути и оптичната плътност (OD) се измерва с помощта на многопластов четец при тестова дължина на вълната 570 nm и референтна дължина на вълната 630 nm.

Анализ на активността на каспаза 3

Анализът на активността на Caspase 3 се извършва съгласно протокола на производителя, използвайки комплект за анализ на Caspase 3 (колориметричен) (Abcam, Сан Хосе, Калифорния, САЩ).

Ензимно свързан имуносорбентен анализ (ELISA)

Клетъчно секретираните нива на TNFα (кат. №: MTA00B), IL-1β (кат. №: DY401-05) и IFNγ (кат. №: MIF00) са измерени с помощта на съответните ELISA комплекти (R&D Systems, Минеаполис, MN, USA) следвайки инструкциите на производителя.

Генно заглушаване с помощта на siRNAs

Малки интерфериращи (si) РНК олигонуклеотиди (0–20 nmol/L), насочени към TNFα, IL-1β и NFκB, бяха закупени от Santa Cruz Biotechnology и трансфектирани за потискане на генната експресия. Трансфекцията с помощта на липофектамин 3000 (Invitrogen) се извършва съгласно указанията на производителя

Анализ на липолиза

Липолизата с използване на колориметричен анализ беше извършена с помощта на комплект за анализ на липолиза Abcam, следвайки указанията на производителя.

Статистически анализ

Всички статистически анализи бяха извършени с помощта на статистическа програма SPSS/PC (версия 13.0 за Windows; SPSS, Чикаго, IL, САЩ). Резултатите се представят като прегъване на най-високите стойности (означава ± SEM). Всички експерименти бяха проведени в три екземпляра. За статистически анализ са използвани тест на Student или еднопосочен ANOVA.

Резултати

Ефектите на PPC върху апоптозата при различни видове клетки

За да оценим ефектите на PPC върху апоптозата при различни клетъчни типове, лекувахме 3T3-L1 адипоцити, C2C12 миоцити, HUVEC и фибробласти с PPC (0–10 mg/ml, 24 часа). Клетъчната жизнеспособност беше измерена с помощта на MTT анализ. Формулата, базирана на PPC, намалява жизнеспособността на 3T3-L1 клетки и увеличава активността на каспаза 3 по дозозависим начин. Интересното е, че PPC лечението не засяга както жизнеспособността на клетките, така и активността на каспаза 3 в миоцитите на C2C12, HUVEC и фибробластите (Фигура 1).

3T3-L1 адипоцитите, C2C12 миоцитите, HUVEC и фибробластните клетки бяха третирани с различни концентрации (0–10 mg/ml) PPC в продължение на 24 часа. Клетките бяха оценени чрез MTT анализ за определяне на жизнеспособността (A) и активността на каспаза 3 (B). Средствата ± SEM са изчислени от три независими експеримента. *** P Фиг. 2. PPC специфично индуцира секреция и експресия на TNFα и IL-1β в адипоцити, но не и в неадипоцити.

3T3-L1 адипоцитите, C2C12 миоцитите, HUVEC и фибробластните клетки бяха третирани с различни концентрации (0–10 mg/ml) PPC в продължение на 24 часа. За измерване на секрецията на TNFa (A) и IL-1β (B) бяха използвани културни среди. Експресията на TNFa и IL-1β тРНК се определя чрез количествен PCR анализ в реално време (С). Клетъчните екстракти се анализират чрез Western blot за определяне на експресията на TNFa и IL-1β (D). За измерване на секрецията на IFNy (E) бяха използвани културни среди. Средствата ± SEM са изчислени от три независими експеримента. *** P Фиг. 3. TNFα и IL-1β допринасят за PPC-медиирана липолиза и апоптоза в адипоцитите.

(А) 3T3-L1 адипоцитите се третират с различни концентрации (0-10 mg/mL) PPC в продължение на 24 часа. Клетките се оценяват чрез анализ на липолиза. Scramble и TNFa или IL-1β siRNAs-трансфектирани 3T3-L1 адипоцити се третират с PPC (10 mg/mL) в продължение на 24 часа. Клетъчните екстракти бяха измерени чрез анализ на липолиза (B), MTT анализ за определяне на жизнеспособността на клетките (C) и активност на каспаза 3 (D). Средствата ± SEM са изчислени от три независими експеримента. *** P! П ! P Фиг. 4. PPC регулира експресията на TNFα и IL-1β чрез ядрена транслокация на NFκB.

(А) 3T3-L1 адипоцитите се третират с различни концентрации (0-10 mg/mL) PPC в продължение на 24 часа. Клетъчните екстракти се анализират чрез Western blot. (B) Трансфектирани 3T3-L1 адипоцити, трансфектирани с NFκB siRNAs, бяха третирани с PPC (10 mg/mL) в продължение на 24 часа. Клетъчните екстракти се анализират чрез Western blot. Средствата ± SEM са изчислени от три независими експеримента. *** Р. П ! P Фигура 5. Схематична диаграма за ефекта на PPC върху липолизата и апоптозата в адипоцитите на 3T3-L1.

Подкрепяща информация

S1 Фиг. Диференциация на 3T3-L1 клетки.

S2 Фиг. PPC насърчава липолизата и апоптозата чрез NFκB-медиирано сигнализиране в адипоцитите.

Тематични области

За повече информация относно предметните области на PLOS кликнете тук.

Искаме вашите отзиви. Имат ли смисъл тези предметни области за тази статия? Щракнете върху целта до неправилната тема и ни уведомете. Благодаря за вашата помощ!

Е тематичната област "Адипоцити" приложим за тази статия? да не

Благодаря за отзивите ви.

Е тематичната област "Липолиза" приложим за тази статия? да не

Благодаря за отзивите ви.

Е тематичната област "Апоптоза" приложим за тази статия? да не

Благодаря за отзивите ви.

Е тематичната област "Фибробласти" приложим за тази статия? да не

Благодаря за отзивите ви.

Е тематичната област "MTT анализ" приложим за тази статия? да не

Благодаря за отзивите ви.

Е тематичната област "Мускулни клетки" приложим за тази статия? да не

Благодаря за отзивите ви.

Е тематичната област "Мастна тъкан" приложим за тази статия? да не

Благодаря за отзивите ви.

Е тематичната област "Колориметрични анализи" приложим за тази статия? да не