Системна микробиология

Редактиран от
Георги Циамис

Университет в Патра, Гърция

Прегледан от
Shuang-yong Xu

New England Biolabs, САЩ

Панайота Статопулу

Университет в Патра, Гърция

Принадлежностите на редактора и рецензенти са най-новите, предоставени в техните профили за проучване на Loop и може да не отразяват тяхното положение по време на прегледа.

microbiota

  • Изтеглете статия
    • Изтеглете PDF
    • ReadCube
    • EPUB
    • XML (NLM)
    • Допълнителни
      Материал
  • Цитат за износ
    • EndNote
    • Референтен мениджър
    • Прост ТЕКСТ файл
    • BibTex
СПОДЕЛИ НА

Оригинални изследвания СТАТИЯ

  • 1 Отдел за човешки микробиоми, Детска болница Bambino Gesù, IRCCS, Рим, Италия
  • 2 Катедра по медицински хирургични науки и биотехнологии, Фармацевтичен и медицински факултет, Бариатричен център за върхови постижения IFSO-EU, Университет Сапиенца, Рим, Италия
  • 3 Катедра по експериментална медицина, Секция по ендокринология, Университет Сапиенца, Рим, Италия
  • 4 Отделение за детска обща хирургия, Детска болница Bambino Gesù, IRCCS, Рим, Италия
  • 5 Отделение за гастроентерология, Катедра по клинична медицина, Университет Сапиенца, Рим, Италия
  • 6 Катедра по педиатрия, Университет Сапиенца, Рим, Италия
  • 7 Отделение за хепатогастроентерология и хранене, болница Bambino Gesù, Рим, Италия
  • 8 Научна дирекция, Детска болница Bambino Gesù, IRCCS, Рим, Италия
  • 9 Отделение по паразитология, Детска болница Bambino Gesù, IRCCS, Рим, Италия

Въведение

През последните няколко десетилетия се наблюдава драматично нарастване на затлъстяването, като общият брой на хората с наднормено тегло и затлъстяване нараства в световен мащаб от 857 милиона през 1980 г. до 2,1 милиарда през 2013 г. (Nicolucci and Reimer, 2016). От особено значение е 47,1% увеличение на разпространението на детското затлъстяване между 1980 и 2013 г. (Nicolucci and Reimer, 2016).

В Съединените щати се наблюдава драстично нарастване на затлъстяването и екстремното затлъстяване от периода 1988–1994 до периода 2013–2014: по-специално юношите със затлъстяване са се увеличили от 10,5 на 20,6%, а юношите с изключително затлъстяване - от 2,6 на 9,1% (Ogden et al., 2016).

Според доклад на Организацията за икономическо сътрудничество и развитие през 2014 г. в Италия приблизително 1 от 10 възрастни е със затлъстяване, докато 40% са с наднормено тегло (включително затлъстяване). По отношение на децата 36% от момчетата и 34% от момичетата са с наднормено тегло или затлъстяване (Организация за икономическо сътрудничество и развитие, 2014 г.).

Детското затлъстяване има тенденция да продължи и в зряла възраст. Следователно затлъстяването при деца предполага както непосредствени, така и непосредствени рискове за съпътстваща заболеваемост, много от които са подобни на наблюдаваните при възрастни (напр. Астма и когнитивни нарушения в детска възраст, диабет, сърдечни заболявания, няколко ракови заболявания, респираторни заболявания, психично здраве и репродуктивни нарушения по-късно в живота) (Adair et al., 2016). Затлъстяването в детска възраст е предизвикателство за общественото здраве, което ще изисква евтини, неинвазивни и целенасочени интервенции (Keating et al., 2011; Kalra et al., 2012; Ogden et al., 2014). За да се предотвратят дългосрочните последици от затлъстяването върху здравето, бариатричната хирургия също се препоръчва при юноши (Leslie et al., 2009). Въпреки това, по-малко от 1% от всички процедури за отслабване в момента се извършват при юноши, въпреки че този процент може да се увеличи с времето (Burguera et al., 2007).

Проучванията върху затлъстели хора и животни са предоставили някои от най-убедителните индикации за сложните и взаимно полезни взаимодействия между бактериите и хората (Cani and Delzenne, 2009; Ridaura et al., 2013). Чревните бактерии участват в регулирането на метаболизма на енергията на гостоприемника и телесната маса (Clarke et al., 2012). По-конкретно, беше показано, че чревната микробиота е ключов фактор за разграждането на несмилаеми хранителни вещества, като растителни полизахариди и фибри (Chiu et al., 2014). Освен това чревната микробиота влияе върху физиологията на гостоприемника и допринася за храненето и метаболитното здраве (Koh et al., 2016). Всъщност модулацията на чревната микробиота чрез консумация на фибри, антибиотично лечение или фекална трансплантация може да има положителни ефекти върху възпалението и чувствителността към инсулин (Robertson et al., 2005; Cani et al., 2008). Променена чревна микробиота е наблюдавана при затлъстяване и T2D (Larsen et al., 2010; Karlsson et al., 2013; Le Chatelier et al., 2013), и по-специално намаленото видово и генно богатство е свързано с затлъстяване, дислипидемия и инсулинова резистентност (Cotillard et al., 2013).

Експериментът за секвениране на генома на няколко чревни организми доказа наличие на ензимни способности, присъщи на чревните бактерии, липсващи в човешкия геном. Това е доказателството, че микроорганизмите правят възможно смилането на хранителни компоненти, които иначе биха били недостъпни за гостоприемника (Xu et al., 2003).

Основната крайна точка на това проспективно проучване беше да се изследва състава на чревната микробиота при затлъстели юноши спрямо възрастни и при здрави тийнейджъри и възрастни с нормално тегло (NW). Вторичната крайна точка беше да се идентифицират специфични микроорганизми и бактериални метаболитни пътища, които корелират със затлъстяването, като се фокусира върху възможните биомаркери, свързани с възрастта.

Материали и методи

Набиране на пациенти и контрол

Пациентите с наднормено тегло са били записани в клиниката за затлъстяване. Двадесет възрастни пациенти с индикация за бариатрична хирургия бяха изследвани, следвайки насоките на Италианското дружество по хирургия на затлъстяването (Sicob 1). Двадесет и пет подрастващи пациенти бяха записани за бариатрична хирургия съгласно указанията на ESPGHAN (Nobili et al., 2015).

За да се получи съпоставено с възрастта изследване на контролен случай, 12 СЗ здрави юноши (CTRL_ado) и 12 СЗ здрави възрастни (CTRL_adult) са били записани като доброволци през същия период в OPBG Metagenomics Human Microbiome Unit и в отдел по клинична медицина на Умберто I Болница, съответно. Анамнестични и клинични данни за пациенти със затлъстяване и CTRL са представени в таблица 1. От всеки субект/пациент се събира единична проба изпражнения и се съхранява при -80 ° C до края на събирането.

МАСА 1. Анамнестични и клинични данни за пациенти и CTRL.

Оценката на съпътстващата заболеваемост и психологическото и хранително консултиране се извършват в амбулаторни условия. Критериите за включване бяха: кавказка раса; възраст 13–19 години за затлъстели юноши (ob_ado) и 20–65 години за затлъстели възрастни (ob_adult); индекс на телесна маса (ИТМ) между 30 и 60 kg/m 2; допустимост за бариатрична хирургия (ръкавна гастректомия). Критериите за изключване бяха: хистологична положителност към Helicobacter pylori; прием на кортикостероиди, антибиотици или предпробиотици през предходните 2 месеца; прием на витамин Е или рибено масло през предходните 2 месеца; хронични стомашно-чревни заболявания или синдроми (напр. IBD и IBS); предишна бариатрична хирургия (изключен интрагастрален балон).

Критериите за здравословно включване в CTRL бяха: ИТМ между 18,5 и 24,9 kg/m 2 за възрастни (Световната здравна организация [СЗО], 2000) и ИТМ между 5-ия и 85-ия процентил на ИТМ за възраст, за юноши (Ogden et ал., 2002), отсъствие на хронични заболявания; липса на стомашно-чревни инфекции през предходните 2 месеца, липса на прием на антибиотици и предпробиотици през предходните 2 месеца, всеядна диета.

Това проучване е проведено в съответствие с препоръките на Комитета по етика на OPBG (Протокол № 768.12) за подрастващи пациенти и от Комитета по етика на болница Umberto I (Протокол № 1003/13) за възрастни пациенти. Всички субекти дадоха писмено информирано съгласие в съответствие с Декларацията от Хелзинки.

Артериалната хипертония се определя съгласно модифицираните критерии на NCEP ATP-III. Кръвното налягане (mmHg) се регистрира след 5 минути почивка с помощта на електронен аускултаторен рекордер за кръвно налягане с подходящ размер маншет и при пациент, седнал в изправено положение. Бяха направени три измервания и средната стойност на второто и третото измерване беше записана и използвана при анализа. Пациентите се считат за засегнати от хипертония, когато стойностите са над 135/80 mmHg.

Нарушеният метаболизъм на глюкозата се определя съгласно критериите на Американската диабетна асоциация (ADA) (American Diabetes Association, 2009). Пациентите са подложени на орален тест за толерантност към глюкоза (OGTT) с измерване на гликемия в изходно ниво и 30, 60, 90 и 120 минути след поглъщането на 75 g глюкоза. Пациентите са определени като нормален глюкозен толерант (NGT) със стойности на гликемия под 140 mg/dl при 120 минути OGTT; нарушен толерант към глюкоза (IGT) със стойности на гликемия между 140 и 200 mg/dl при 120 минути OGTT; пациенти с диабет тип 2 (DMT2) със стойности на гликемия над 200 mg/dl.

Геномна ДНК екстракция, пиросеквенция и количествен анализ на микробиомния състав

Геномна ДНК беше изолирана от целия набор от 69 проби изпражнения, използвайки QIAamp DNA Stool Mini Kit (Qiagen, Германия). Количеството и качеството на ДНК се оценява от спектрофотометър NanoDrop TM 2000/2000c (Thermo Scientific, Wilmington, MA, САЩ). За 16S rRNA-базирана метагеномика, V1-V3 регионите (520 bp) на гена 16S rRNA бяха усилени, за да се получи бактериална библиотека, използвайки универсални бактериални праймери (FW 5′-GAGTTTGATCNTGGCTCA G-3 ′, RV 5′-GTNTTACNGCGGCKGCGG ′). Праймерите бяха баркодирани от осем уникални нуклеотидни последователности (Roche 454 Life Sciences, Branford, CT, САЩ). За да се гарантира висока специфичност, чувствителност и точност на PCR реакцията, беше използвана Hi-Fi PCR Taq полимераза (FastStart TM High Fidelity PCR System, dNTPack, Roche Diagnostics, Mannheim, Germany). За да се ограничат честотите на PCR грешки на базата и химерните последователности, бяха приложени 40 цикъла на PCR, 5 минути време за удължаване, ниски концентрации на шаблон (1 ng) (Lahr and Katz, 2009). Всяка проба е била подложена на пиросеквенционна реакция на 454-Junior Genome Sequencer (Roche 454 Life Sciences, Branford, CT, САЩ), съгласно инструкциите на производителя.

Обработката на сигнала 454 Amplicon беше използвана като първо филтриране на резултатите, поради което чрез софтуера QIIME 1.8.0 бяха анализирани последователностите (Caporaso et al., 2010). След демултиплексиране от анализа бяха изключени отчитанията със среден качествен резултат по-нисък от 25, по-кратък от 300 bp и с двусмислено базово повикване Последователностите, преминали през филтъра за качество, бяха деноминирани (Reeder и Knight, 2010) и единичните точки бяха изключени. Деноминираните последователности бяха проверени от химера identify_chimeric_seqs.py като се използват или Blast_fragments и ChimeraSlayer 2 подходи. Оперативните таксономични единици (OTU), дефинирани с 97% сходство, бяха избрани и представителните последователности бяха изпратени на PyNAST за подравняване на последователностите (Caporaso et al., 2010) и на UCLUST за групиране на последователности (Edgar, 2010). Базата данни за съвпадение на OTU беше greengenes (v 13.8). След разреждане, α- и β-разнообразието и тестовете ANOSIM бяха проведени от софтуера QIIME, използвайки alpha_rarefaction.py, beta_diversity_through_plots.py, compare_categories.py скриптове; на group_significance.py скриптът е използван за извършване на OTUs тест на Kruskal – Wallis (Navas-Molina et al., 2013).

Статистически анализ

Оперативните таксономични единици, присъстващи в по-малко от 25% от пробите, бяха отстранени преди прилагането на статистически анализ. В края на процеса на филтриране таксоните, взети под внимание за последващи статистически анализи, бяха намалени до 47/222 OTU.

Статистически тестове [тест на Шапиро – Уилк, ANOVA, тест с най-малка значима разлика (LSD), Ман – Уитни U-тест, работна характеристика на приемника (ROC), анализ на дискриминанта (DA), анализ на главните компоненти (PCA), тест на Wilks ’Lambda, корелации на Spearman] бяха извършени от IBM SPSS статистически софтуер версия 21.

За да се предскаже метагеномно функционално съдържание от 16S rRNA генни проучвания, е приложен инструмент Picrust v 1.1.0 (Langille et al., 2013) и за да се получат пътищата KEGG (Киото енциклопедия на гени и геноми) 3, ние анализирахме предвиждането на функцията чрез HUMAnN2 v0.99 програма (Abubucker et al., 2012). Освен това, за да се намерят биомаркери на KEGGs, свързани с юношеско затлъстяване и CTRL състояния, е извършен анализ на линейния дискриминант на ефекта (LeFse) (α стойност = 0,05, праг на логаритмичен LDA резултат = 2,0) (Segata et al., 2011).

Хранилище за отворен достъп на MG данни

Четенето на секвениране и свързаните с него метаданни са достъпни в NCBI: Биопроекти: PRJNA356507, метагеномен профил на червата от пациенти със затлъстяване; PRJNA280490, метагеномичен профил на червата от здрави индивиди 4 .

Резултати

Профили на микробиота при затлъстели пациенти и в здравословен контрол

Бяха получени общо 139 783,00 четения на секвенции от 69 фекални проби, със средна стойност от 2025,84 секвенции на проба. Идентифицирахме общо 222 OTU, групирани в 14 типа и 79 семейства.

За да се оценят общите разлики в структурите на микробната общност при пациенти и CTRL, ние измерихме екологични параметри въз основа на алфа-разнообразие (ChaoI, индекси на Шанън).

Най-високата средна стойност на индекса ChaoI е получена за групата CTRL_ado (242.28), последвана от групите CTRL_adult (180.23), ob_ado (166.03) и ob_adult (149.28) (допълнителна фигура S1A). Средните стойности на индекса на Шанън са сходни сред четирите групи (допълнителна фигура S1B).

За да определим разликите между структурите на микробната общност при пациенти със затлъстяване и CTRLs, изчислихме β-разнообразие. Нашите резултати показаха, че чрез претегления анализ на UniFrac първата координата (PC1) обяснява 30,23% от вариацията на пробите (стр = 0,01; Фигура 1А), докато нетегленият анализ на UniFrac обяснява 11,05% при затлъстелите спрямо CTRL групата (стр = 0,01; Фигура 1В). Стратифицирайки проби по възраст, установихме, че двете подрастващи групи (ob_ado и CTRL_ado) образуват по-дефинирани и разделени клъстери от групите за възрастни (стр = 0,01; Фигури 1Б, Г).

ФИГУРА 1. Анализ на главните координати (PCoA) на групи със затлъстяване и CTRL (A – C), и на CTRL_ado, CTRL_adult, ob_ado и ob_adult групи (B – D). Графиките показват първите две основни координати (оси) за PCoA с помощта на претеглена (A, B) и непретеглени (C, D) Алгоритъм на UniFrac.

Групирайки OTU на ниво филум, взехме предвид относителното изобилие на петте основни тила (например Actinobacteria, Bacteroidetes, Firmicutes, Proteobacteria и Verrucomicrobia). Прилагайки теста на Крускал – Уолис върху относителното изобилие на фила за четирите групи, ние наблюдавахме статистически значими разлики в разпределението на Actinobacteria, Bacteroidetes и Firmicutes (стр 0.7) в състояние да дискриминира ob_ado (А) и CTRL_ado (Б) групи.

Корелации между клинични/антропометрични характеристики и изобилие от бактерии

За да оценим корелациите между бактериите и клиничните и антропометрични характеристики (например възраст, пол, ИТМ, наличие на диабет и хипертония), ние избрахме граничните стойности на rho на Spearman, като също взехме предвид r > 0,4, r Ключови думи: чревна микробиота, затлъстяване, бактериални маркери, метаболитни пътища, дисбиоза

Цитиране: Del Chierico F, Abbatini F, Russo A, Quagliariello A, Reddel S, Capoccia D, Caccamo R, Ginanni Corradini S, Nobili V, De Peppo F, Dallapiccola B, Leonetti F, Silecchia G и Putignani L (2018) Gut Маркери на микробиота при затлъстели юноши и възрастни пациенти: Диференциални модели, зависими от възрастта. Отпред. Микробиол. 9: 1210. doi: 10.3389/fmicb.2018.01210

Получено: 30 ноември 2017 г .; Приет: 17 май 2018 г .;
Публикувано: 05 юни 2018 г.

Джордж Циамис, Университет в Патра, Гърция

Shuang-Yong Xu, New England Biolabs, САЩ
Панайота Статопулу, Университет в Патра, Гърция