1 Катедра по нефрология и ревматология, Десета болница на Шанхай, Университетско училище Tongji, Шанхай 200072, Китай

бъбречно

2 Катедра по обща хирургия, болница Zhongshan, Fudan University, Шанхай 200032, Китай

3 Отделение по патология, Шанхайска десета болница, Медицинско училище в университета Тонджи, Шанхай 200072, Китай

4 Катедра по обща хирургия, Шанхайска десета болница, Медицинско училище в университета Тонджи, Шанхай 200072, Китай

Резюме

1. Въведение

Хроничното бъбречно заболяване (ХБН) е често срещано хронично заболяване и често прогресивно се развива като краен стадий на бъбречно заболяване [1]. Средният период на преживяемост е 4,25 години при пациенти с уремия, а 1-годишната, 3-годишната и 5-годишната преживяемост са съответно 88%, 68% и 46% [2]. Съобщава се, че ХБН е класиран на 27-мо място сред глобалните смъртни случаи през 1990 г., но се е увеличил на 18-то място през 2010 г. и броят също се увеличава през последните няколко години [3]. В клиничната практика пациентите, страдащи от ХБН, се нуждаят от повече медицински и социални грижи, увеличавайки медицинските разходи и влияещи върху качеството на живот [4–7]. Ето защо, как да се забави прогресирането на болестта и проучване на ефективни лечения за намаляване на усложненията са популярни занимания в съвременната нефрология.

Освен това, както знаем, има много уремични токсини в тялото на пациенти с ХБН, особено в червата [23]. Тези уремични токсини могат да причинят оксидативно стресово увреждане на органите или тъканите, когато повишените видове свободни радикали кислород преодолеят нормалната способност на организма да ги елиминира [24, 25]. Малондиалдехидът (MDA) е краен продукт на липидната пероксидация в процеса на оксидативен стрес, а супероксиддисмутазата (SOD), каталазата (CAT) и глутатионпероксидазата (GSH-PX) са основните антиоксидантни ензими, предпазващи организма от оксидативен стрес . Тези биомаркери се използват често за оценка на оксидативния стрес в много изследвания [26-28]. Досега обаче също е неизвестно дали увреждането на оксидативния стрес е свързано с увреждането на чревната лигавица при прогресията на ХБН.

Следователно, в настоящото проучване имаме за цел да изследваме дали чревната лигавична бариера е била повредена или не при прогресията на ХБН и състоянието на оксидативен стрес, отговорен за основния механизъм.

2. Материали и методи

2.1. Декларация за животните и етиката

Здрави възрастни мъжки плъхове Sprague-Dawley (с тегло от 170 до 200 g) са получени от болницата на Десетия народ в Шанхай, Шанхай, Китай. Плъховете бяха настанени в нашата лаборатория в контролирана от температура и влажност среда. Всички плъхове бяха настанени при нормален 12-часов цикъл светлина/тъмнина и с достъп до храна и вода ad libitum. Този протокол за употреба и грижи за животните и експериментални процедури бяха разгледани и одобрени от институционалния комитет за грижи и употреба на животните от болницата на Десетия народ в Шанхай. Експериментите са извършени и съгласно Насоките на Националния институт по здравеопазване относно използването на лабораторни животни.

2.2. Експериментален протокол и вземане на проби

След адаптационен период за една седмица, шестдесет и четири плъха бяха разделени на случаен принцип в две групи: контролна група и уремична група, с 32 във всяка. Моделът на уремия при плъхове се индуцира чрез резекция на бъбреците 5/6, както е описано в предишното проучване [29]. Накратко, след пълна анестезия с подкожно инжектиране на 2% пентобарбитал натрий (3,5 ml/kg), плъховете от групата на уремиите са подложени на лапаротомия с 2 cm дорзален разрез, след което 2/3 от левия бъбрек е отстранен и седем дни по-късно беше отстранен целият десен бъбрек. Контролната група премина през същите две процедури, но без никаква бъбречна резекция. Хирургичните процедури са извършени в асептична среда с контролирана температура и влажност.

През следоперативните седмици 4, 6, 8 и 10 бяха избрани произволно осем плъха от всяка група и бяха взети проби от кръв и чревни тъкани, след като животните бяха напълно обезболени. Взети са кръвни проби от долната куха вена и серумът се приготвя чрез центрофугиране при скорост от 1500 об/мин за 15 минути при 4 ° C и след това серумът се съхранява при -80 ° C за анализи на цитокини и D-лактат Нива (D-LA) и активност на диамин оксидаза (DAO). Крайният илеум се събира за анализи на чревната пропускливост, нивата на оксидант и антиоксидант и хистопатологията. Трябва да се отбележи, че изборът на терминален илеум като място за изследване се основава на предишните проучвания [30–32]. Тези проучвания показват, че крайният илеум е основното място за наблюдение на увреждане на чревната лигавична бариера при различни заболявания. Предполага се, че терминалният илеум е най-чувствителният участък на чревния тракт [33].

2.3. Фактор на серумна туморна некроза-Алфа (TNF-α), Интерлевкин-6 (IL-6) и IL-10 Определяне

Нивата на цитокини тумор TNF-α, IL-6 и IL-10 в серума се определят, като се използва ELISA комплект за плъхове (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA), съгласно инструкциите на производителя. Стойностите са изразени като pg/mL в серума.

2.4. Определяне на серумни D-LA и DAO

Нивата на D-LA и активността на DAO в серума се определят с помощта на комплекти ELISA за плъхове (за D-LA, R&D Systems, Минеаполис, MN, САЩ; за DAO, Nanjing Jiancheng Biocompany, Nanjing, Китай) в съответствие с инструкциите на производителя . Нивото на D-LA се изразява като mmol/L в серума, а DAO активността се изразява като U/mL в серума.

2.5. Определяне на чревната пропускливост

Чревната пропускливост се определя чрез измерване на чревния клирънс на флуоресцеин-изотиоцианат декстран (FD4), както се съобщава в предишните ни проучвания [15, 30, 34]. Накратко се събира терминален сегмент на илеума с дължина 8 cm и лигавицата внимателно се изветрява. В единия край чревният сегмент се лигира, а от другия край се приготвя чревна торбичка чрез инжектиране на 1,0 ml бикарбонатен буфер на Krebs-Henseleit. След това напълнената торбичка се инкубира в разтвор, съдържащ 0,5 mg/ml FD4 (средно молекулно тегло: 4000) при контролирана температура с 37 ° С. Разтворът за къпане също се аерира чрез внимателно барботиране с газова смес, съдържаща 5% CO2 и 95% O2. Тридесет минути по-късно стойността на повърхността на лигавицата (

) беше измерена. След това флуоресценцията на разтвора се измерва с флуоресцентен спектрофотометър и чревният клирънс на FD4 се изчислява съгласно следната формула:

В тази формула е мукозно-серозалният клирънс на FD4 в μL · min −1 · cm -2, е концентрацията на FD4 в серозната течност, аспирирана от чревната торбичка в края на периода от 30 минути, е концентрацията на FD4 в лигавичната течност, аспирирана от чревната торбичка в началото на Период от 30 минути е дължината на чревната торбичка и диаметърът на чревната торбичка.

2.6. Чревно определяне на MDA, SOD, CAT и GSH-PX

Крайният илеум се хомогенизира и центрофугира при скорост от 4000 об/мин в продължение на 15 минути при 4 ° С и след това се получава супернатантата. Нивото на MDA и активността на SOD, CAT и GSH-PX в супернатантите се определят с помощта на търговските комплекти за анализ (Nanjing Jiancheng Biocompany, Nanjing, China) в съответствие с инструкциите на производителя. Нивото на MDA се изразява като nmol/mg в тъканта, а активността на SOD, CAT и GSH-PX се изразява като U/mg в тъканта.

2.7. Хистологично наблюдение

Крайният илеум беше фиксиран с 10% буфериран формалдехид и вграден в парафин. Резени от 4 μНаправени са дебели m, оцветени с хематоксилин и еозин (H&E) и след това наблюдавани от двама патолози, заслепени от този дизайн на изследването със светлинна микроскопия. Инфилтрацията на възпалителни клетки като неутрофили се използва за оценка на чревното възпаление в чревната лигавица и субмукоза [30]. Степента на увреждане на чревната лигавица е количествено оценена, използвайки системата за оценяване на Chiu, докладвана от Chiu et al. [35].

2.8. Статистически анализ

Данните бяха изразени като средната стойност ± SD. Статистическите анализи бяха направени с помощта на софтуера SPSS 17.0 (SPSS Inc., Чикаго, САЩ). Данните първо получиха тест за хомогенност за дисперсия и след това бяха анализирани с помощта на Student’s

-тест, с изключение на резултатите на Chiu, като се използва еднопосочен дисперсионен анализ, последван от теста за най-малка значима разлика за многогрупови сравнения. Разликите се считат за статистически значими, когато

3. Резултати

3.1. Общи наблюдения

Всички плъхове оцеляват в целия експеримент. Четири седмици след операцията, изразен модел на уремия на плъхове, както се посочва от повишаването на серумните концентрации на креатинин и азот в урея в кръвта (Фигура 1), беше индуциран успешно. В сравнение с контролните плъхове, приемът на храна и движението на плъховете в групата на уремиите очевидно намаляват.


, спрямо контролна група.

3.2. Серумни нива на цитокини TNF-α, IL-6 и IL-10

Резултатите са показани на Фигура 2. Серумните нива на TNF-α, IL-6 и IL-10 в групата на уремиите показват повишена тенденция във времето и тези нива на цитокини са били по-високи от тези в контролната група във всички изследвани моменти от време. За провъзпалителния цитокин TNF-α, имаше значителна разлика между групата на уремията и контролната група в постоперативна седмица 10 (). За провъзпалителния цитокин IL-6 разликата между тези две групи достига значимост в постоперативните 8 и 10 седмици (). В допълнение, и в двете следоперативни седмици 8 и 10, серумното ниво на противовъзпалителния цитокин IL-10 на уремичната група също е значително увеличено в сравнение с това на контролната група ().


, спрямо контролна група по едно и също време.

3.3. Серумни D-LA нива и DAO активност

Резултатите са показани на Фигура 3. Серумните нива на D-LA и активността на DAO в групата на уремиите показват повишена тенденция във времето и тези нива на биомаркери са по-високи от тези в контролната група във всички изследвани моменти от време. За D-LA имаше значителна разлика между групата на уремията и контролната група в постоперативните седмици 6, 8 и 10 (). За DAO разликата между тези две групи достига значимост в 8 и 10 седмици след операцията ().


, спрямо контролна група по едно и също време.

3.4. Чревна пропускливост

Резултатите са показани на Фигура 4. Чревният клирънс на FD4 в групата на уремиите показва повишена тенденция във времето и тези нива на биомаркери са по-високи от тези в контролната група във всички изследвани моменти от време. В постоперативните 8 и 10 седмици, чревният клирънс на FD4 на уремичната група е значително увеличен в сравнение с този на контролната група ().


, спрямо контролна група по едно и също време.

3.5. Хистопатология

Резултатите са показани на Фигура 5. Не се наблюдава очевидно структурно увреждане в чревната тъкан между групата на уремията и контролната група във всички изследвани моменти от време. Въпреки това се наблюдават отоци и възпалителни клетки в чревната лигавица и субмукоза в групата на уремия в сравнение с тези в контролната група. В допълнение, както е показано на Фигура 6, групата на уремиите показва повишена тенденция в резултата на Chiu с течение на времето, а резултатите в постоперативната седмица 8 и 10 са по-високи от тези в постоперативна седмица 4 ().



, срещу група на уремия при военнопленни 4.

3.6. Чревни нива на MDA, SOD, CAT и GSH-PX

Резултатите са показани на Фигура 7. Чревните нива на MDA, SOD, CAT и GSH-PX в групата на уремиите показват повишена тенденция във времето и тези нива на биомаркери са били по-високи от тези в контролната група през цялото изследвано време точки. За MDA и SOD разликите между тях в групата на уремията и контролната група достигнаха значимост в 8 и 10 седмици след операцията (). Освен това, в следоперативна седмица 10, чревните нива на GSH-PX от уремичната група са значително увеличени в сравнение с тези от контролната група (). Въпреки това, чревните нива на CAT на групата на уремиите не са се увеличили значително в сравнение с тези на контролната група във всички изследвани моменти от времето (


, спрямо контролна група по едно и също време.

4. Дискусия

ХБН е често срещано хронично заболяване и често прогресивно се развива като краен стадий на бъбречно заболяване [1]. В клиничната практика пациентите с ХБН често страдат от различни усложнения [8, 12] и поради това може да се нуждаят от повече медицински и социални грижи, увеличавайки медицинските разходи и влияещи върху качеството на живот [4–6]. Основната цел е да се намалят усложненията, така че да се забави прогресията на заболяването. Има обаче ограничени проучвания, свързани с причината за усложненията, последвани от ХБН. Както знаем, различните инфекциозни заболявания са едно от основните усложнения на ХБН и могат да доведат до влошаване на ХБН [8–10]. Например смъртността може да се увеличи драстично при пациенти с уремия с белодробни инфекции, а инфекциозните заболявания също могат да доведат до допълнително увреждане на бъбреците и други органи или тъкани [12]. Въпреки това мястото на произход на тези инфекции след прогресията на ХБН все още е неизвестно.

В заключение, нашите резултати предполагат, че напредналата ХБН може да предизвика увреждане на чревната лигавица и допълнително да доведе до системно възпаление, а основният механизъм може да бъде свързан с увреждането на оксидативния стрес в червата. Следователно запазването на чревната лигавична функция чрез ефективни методи може да се разглежда като потенциална цел за терапии, насочени към предотвратяване на инфекциозни усложнения след прогресия на ХБН.

Конкуриращи се интереси

Авторите не декларират конкуриращи се интереси.

Благодарности

Настоящото проучване е подкрепено от Националната фондация за естествени науки на Китай (№ 81101414). Авторите благодарят на целия персонал в централната лаборатория, Шанхайската десета болница, свързана с университета Тонджи, Шанхай, Китай, за отличната техническа помощ.

Препратки