Резюме

Нов аналитичен метод газова хроматография, комбинирана с UV спектрофотометрия, беше използвана за измерване на изопрен и ацетон при издишан дъх, събрани от четири различни групи деца: 1) здрави новородени бебета, 2) здрави деца в предучилищна възраст, 3) здрави ученици, и 4) деца с диабет в различни метаболитни състояния. Както изопренът, така и ацетонът могат лесно да бъдат определени в един-единствен анализ на 250-милилитрова проба въздух. Новородените бебета през първата седмица след раждането са имали неоткриваеми или много ниски нива на изопрен във издишания въздух, независимо от катаболното или анаболното състояние. Дишането на изопрен се увеличава с възрастта и здравите ученици имат по-високи нива от здравите деца в предучилищна възраст. Не са установени значителни разлики в изопрена за дишане при здрави деца и деца с диабет. Установено е, че дишането на ацетон корелира с метаболитното състояние както при новородени бебета, така и при деца с диабет. Тези открития илюстрират потенциалното използване на нова техника за анализ на дишането при деца с метаболитни нарушения.

Един проблем с няколко доклада, занимаващи се с анализ на издишани летливи въглеводороди, е неспособността да се направи разлика между изопрен и пентан. Тъй като изопренът и пентанът се съчетават в повечето хроматографски колони (18, 19), много предишни доклади може да са съобщили несъзнателно изопрен като комбинация от изопрен и пентан. Наскоро описахме силно чувствителен и специфичен метод за анализ на изопрен в човешкото дишане (20), базиран на газова хроматография с UV диодна детекция (21). С този метод е възможна недвусмислена идентификация на изопрен чрез съчетаване на спектъра на ултравиолетово абсорбиране на биологичната проба с автентичен изопренов стандарт. Освен това, с този метод за анализ, изопренът за дишане не може да бъде объркан с дишането на пентан, тъй като наситените въглеводороди като пентан и етан не абсорбират UV лъчение в същия диапазон на дължините на вълната, както изопренът.

За да тестваме хипотезата, че изопренът от дишането може да се увеличи при диабет, сега използваме този метод за определяне на изопрен при дишане на здрави деца от различни възрасти и деца с диабет с различни метаболитни състояния. Освен това, за да се изследва дали изопренът на дъха се влияе от метаболитното състояние в неонаталния период, изопренът за дъх се определя при новородени с различни метаболитни състояния (катаболен и анаболен). Ацетонът се определя в същите проби от дишането, като по този начин дава възможност да се сравнява издишването на изопрен с това на добре установен метаболитен маркер. Изследването е одобрено от Комитета по етика на Факултета по здравни науки.

МЕТОДИ

Субекти. Децата, участващи в разследването, бяха групирани в четири категории, наричани новородени бебета, деца в предучилищна възраст, деца в училище и деца с диабет. Що се отнася до новородените бебета, беше анализиран въздух с издишване от осем доносени бебета. Всички новородени са здрави, без перинатални усложнения и с тегло при раждане, подходящо за гестационната възраст. Спонтанно издишаният въздух се събира след 1-3 d (когато постнаталната загуба на тегло е между 3,0 и 10,8%) и на d 4-7 (тъй като теглото се е увеличило с 1,1-6,4%). При 23 здрави деца в предучилищна възраст, на възраст от 1,5 месеца до 6 години, проби от издишан въздух бяха взети при обикновен преглед в клиниката за бебета в кладенеца.

ацетон

Газова хроматография-UV анализ на изопрен и ацетон при издишване. Триизмерният сюжет показва 1) UV-спектралната дължина на вълната (в нанометри) по протежение на х ос, 2) абсорбцията на двете съединения (пропорционална на концентрацията) по протежение на у ос и 3) времето на задържане (в секунди) на отделените съединения по протежение на z ос.

Количествените оценки бяха направени от хроматограмите, образувани при 214,5 nm (изопрен) и 193,9 nm (ацетон). Интегрираните стойности от анализа на пробата бяха сравнени с тези на стандартите, инжектирани директно в уреда. Стандартите за въздушни пари за ацетон и изопрен се приготвят от изходни разтвори, съдържащи 0,2% (обем/обем) ацетон и 0,02% (обем/обем) изопрен в хексан. Стандартните криви бяха получени чрез инжектиране на точно измерени обеми (1, 2, 3 и 4 µL) от този разтвор в газовия хроматограф за анализ чрез UV диодна детекция. Отговорът на откриване е линеен в диапазона на концентрациите, срещан в пробите за дишане. Освен това, когато в контролните експерименти се анализира въздух в помещението (250 ml), ацетонът и изопренът не могат да бъдат открити.

Повторният анализ на една и съща проба за дишане показва коефициент на вариация от 9% както за изопрен, така и за ацетон. Концентрациите на изопрен и ацетон в тефлоновата торбичка са стабилни за 1 ден, но след това намаляват; следователно адсорбцията на съединенията върху адсорбиращите епруветки се извършва в рамките на 1 d след вземането на проби от дишането.

Всички химикали и разтворители, използвани по време на разследването, са с аналитично качество и са доставени от Merck (Дармщат, Германия). Изопрен (99% чистота) е закупен от Sigma Chemical Co. (Сейнт Луис, Мисури).

Статистически определяния. Значимост на разликите, дадени като стр стойности, бяха изчислени съгласно Wilcoxon подписан ранг тест (за свързани проби) и Wilcoxon тест (за независими проби), използвайки компютърния пакет SPSS (SPSS Inc., Чикаго, IL). Връзките между възрастта и концентрациите на дишането се анализират чрез линейна регресия, като възрастта е независимата променлива.

РЕЗУЛТАТИ

Изопрен. Концентрациите на изопрен и ацетон във въздуха с издишан въздух от здрави деца и деца с диабет са илюстрирани в таблица 1 и фигури 2 и 3. Новородените бебета са имали неоткриваеми или много ниски нива на изопрен при издишване, но само след няколко седмици като цяло е имало малко по-голяма екскреция. На няколко месечна възраст в дишането бяха открити нарастващи концентрации на изопрен и имаше тенденция към по-високи концентрации с увеличаване на възрастта (r = 0,55; стр Таблица 1 Концентрация на ацетон и изопрен при издишан дъх при здрави деца и деца с диабет

Нива на изопрен при издишан дъх на 41 различни възрастни здрави деца (23 деца в предучилищна възраст и 18 деца в училище). Показани са резултатите от линейния регресионен анализ на връзката между възрастта и дъха изопрен, като възрастта е независимата променлива.

Нива на ацетон при издишан дъх на 41 различни възрастни здрави деца (23 деца в предучилищна възраст и 18 деца в училище). Показани са резултатите от линейния регресионен анализ на връзката между възрастта и дихателния ацетон, като възрастта е независимата променлива.

Не са открити разлики в изопрена на дъха, нито между новородените бебета в анаболно и катаболно състояние (стр = 0,463), нито между деца с диабет и недиабет (стр = 0,229). Освен това концентрациите на изопрен в дъха са били приблизително еднакви при пациенти с диабет, независимо дали са гладували или са получавали инсулин и храна (стр = 0,674).

Ацетон. Фигура 3 показва вдишване на ацетон при здрави деца от различни възрасти. Има тенденция към по-ниски концентрации с увеличаване на възрастта. Здравите ученици имат по-ниски стойности от здравите деца в предучилищна възраст (стр = 0,010).

Новородените бебета в катаболни състояния издишват по-високи концентрации на ацетон, отколкото новородените в анаболни състояния (стр = 0,012). Освен това децата с диабет са имали много по-високи концентрации, отколкото здравите деца (стр = 0,001). По-нататъшно повишаване на дишането на ацетон е установено при някои от децата с диабет след натоварването със закуска.

ДИСКУСИЯ

Що се отнася до нивата на изопрен, открихме неоткриваеми или много ниски нива в издишания дъх от новородени бебета. Тези резултати потвърждават ранните открития на Jansson и Larsson (9). Интересното е, че тези пионери изследователи съобщават, че в проби от издишан въздух от новородени бебета (на възраст до 1 седмица) не е открит изобщо изопрен. Само след няколко седмична възраст установихме увеличаваща се екскреция на изопрен от дъха и нашите данни показват връзка между концентрацията на изопрен в дъха и възрастта (фиг. 2). Децата с диабет са имали доста постоянна концентрация на изопрен в дъха независимо от метаболитното състояние и с подобна големина като здравите деца (Таблица 1).

Биологичните последици от издишването на изопрен остават да бъдат изяснени. По-ранни доклади предполагат, че количеството изопрен, елиминиран чрез дишането, не се влияе от диетата, възрастта, пола или гладуването (11), а се влияе от режима на сън (22,23). Изопренът се счита за ендогенно съединение (24,25), но също така се влияе от излагане на екзогенни агенти, като тютюнев дим (26,27) или озон (16), и наскоро беше доказано, че предизвиква неоплазия на множество органи в гризачи след излагане на вдишване (28). По този начин, биосинтезът, оборотът и моделът на екскреция на изопрен може да отразяват някои основни биохимични процеси, които все още предстои да бъдат изследвани. Освен това, дори ако изопренът е определен в човешката кръв (23,25), все още не е ясно дали дъхът изопрен отразява концентрацията в кръвта, циркулираща през белите дробове, или се генерира локално в белите дробове и/или горните дихателни пътища.