Резюме

Затлъстяването е свързано с повишен риск от развитие на инсулинова резистентност (IR), диабет тип 2 и сърдечно-съдови заболявания (1). Много от метаболитните последици от затлъстяването са резултат от дисфункция на мастната тъкан (AT). Последните открития са свързани с натрупването на имунни клетки в AT като ключов фактор за възпалението, свързано със затлъстяването. Добре установено е, че вродените имунни клетки, включително макрофагите, се натрупват в AT по време на затлъстяване и са основен източник на възпалителни цитокини/хемокини, получени от AT (2–4).

увеличава

В допълнение към вродените имунни клетки, скорошни доказателства сочат участието на адаптивната имунна система в инициирането на AT възпаление по време на затлъстяване. При хранене с високо съдържание на мазнини (HFD), делът на AT-резидентните противовъзпалителни лимфоцити, включително CD4 + регулаторни Т-клетки (5) и Т-помощни (Th) 2 клетки (6), намалява. Освен това, затлъстяването насърчава притока на провоспалителни лимфоцити като B-2 клетки (7), естествени убийствени Т клетки (8,9), интерферон-y (IFN-γ) -секретиращ CD4 + Th1 (6,10–12), и CD8 + цитотоксични Т клетки (10,11,13,14) в AT. Изглежда, че натрупването на Т-клетки в AT се управлява от антиген (6,14) и също се характеризира с образуването на клетки на паметта (10,11). Интересното е, че предотвратяването на натрупването на подвъзпалителни Т-клетъчни подгрупи в AT по време на затлъстяване подобрява системния глюкозен толеранс (6,14), което показва, че преминаването към Th1 имунен отговор допринася за развитието на AT възпаление и IR по време на затлъстяването.

Загубата на тегло е идеалният подход за противодействие на негативните последици от затлъстяването. Начинът на живот или хирургичните интервенции, които насърчават загубата на тегло, намаляват броя на AT макрофагите (ATM), намаляват възпалението и подобряват чувствителността към инсулин (15-17). Въпреки това, дори когато се постигне загуба на тегло, загубите рядко се поддържат (18). Тези пристъпи на възстановяване на теглото водят до колоездене с тегло. Въпреки че литературата относно въздействието на колоезденето върху теглото върху метаболитното здраве остава противоречива (19–22), множество проучвания показват, че колоезденето с тежести увеличава риска от развитие на диабет тип 2 и сърдечно-съдови заболявания при хората (23–27). Въпреки че потенциалните вредни ефекти от колоезденето с тежести се разпознават, механизмите, чрез които колоезденето с тегло увеличава метаболитната дисфункция, остават неизвестни. Освен това не е известно дали колоезденето с тегло променя състава на имунните клетки.

В това проучване мишките са циклирани между HFD и диета с ниско съдържание на мазнини (LFD), за да се определи дали циклирането с тегло променя метаболитните и имунологичните параметри в сравнение с мишките, които наддават на тегло при липса на цикли. Ние показваме, че колоезденето с тегло влошава системния глюкозен толеранс и намалява AT инсулиновата чувствителност. Циклирането с тежести не е променило индуцираното от HFD увеличение на броя на ATM или поляризацията на M1. Въпреки това, както CD4 +, така и CD8 + T-клетъчните номера бяха увеличени в AT по време на циклично тегло. В допълнение, популациите на Т-клетки на ефекторна памет CD8 + бяха увеличени по време на циклиране на затлъстяването и теглото. Този засилен възпалителен отговор, стимулиран от Т-клетките, може да допринесе за метаболитните аномалии, свързани с цикличното тегло.

ПРОЕКТИРАНЕ И МЕТОДИ НА ИЗСЛЕДВАНИЯТА

Животни.

Мъжки мишки C57Bl/6J са закупени от лабораторията Jackson. На 8-седмична възраст мишките бяха поставени на 60% HFD или 10% LFD, и двете закупени от Research Diets (New Brunswick, NJ; HFD: D12492; LFD: D12450B). Мишките се хранят ad libitum и им се предоставя свободен достъп до вода. Всички процедури с животни бяха извършени с одобрение от институционалната комисия за грижи и употреба на животните от университета Вандербилт.

Тегло и състав на тялото.

Теглото на тялото се измерва седмично. Общата чиста и мастна маса се измерва чрез ядрено-магнитен резонанс с помощта на инструмент Bruker Minispec (Bruker, Woodlands, TX).

Събиране и измерване на плазмата.

Мишките са гладували в продължение на 5 часа и са вземали кръв от ретро-орбиталния венозен плексус, използвайки хепаринизирани епруветки за събиране. Плазмата се отделя чрез центрофугиране. Инсулинът се измерва с помощта на комплект ELISA за инсулин от плъх/мишка (Millipore, Billerica, MA).

Тестове за толерантност към глюкоза.

Пет-часови гладни мишки бяха обезкървени от вената на опашката и беше измерена изходната глюкоза в кръвта. След това на мишките се инжектира 2 g/kg чиста маса декстроза (Hospira, Inc., Lake Forest, IL). Кръвната глюкоза се оценява в посочените времена.

RT-PCR в реално време.

Изолирането на РНК и RT-PCR в реално време се извършват, както е описано по-горе (28). Всички гени бяха анализирани с помощта на метода Pfaffl (29), нормализиран до глицералдехид-3-фосфат дехидрогеназа и представен като експресия спрямо групата LF/LF/LF.

Western blot анализ.

Петнадесет минути преди умъртвяването, 5-часови гладни мишки се инжектират интраперитонеално с физиологичен разтвор или 0,5 единици човешки инсулин/kg обща телесна маса (Novo Nordisk, Princeton, NJ). Замразеният епидидимален AT, черен дроб и гастрокнемиален мускул се обработват с ултразвук в 2% SDS с 1 mmol/L натриев ортованадат и 0,5 mmol/L фенилметилсулфонил флуорид. Количественият белтък се определя с помощта на BCA анализ (Thermo Scientific, Rockford, IL). Мембраните бяха имуноблотирани с антитела, генерирани срещу AKT или фосфо-AKT (Ser473), и двете закупени от Cell Signaling Technology (Danvers, MA). Интензитетът на лентата е количествено определен с помощта на софтуера ImageJ (National Institutes of Health, Bethesda, MD).

Разделяне на стромална съдова фракция и поточна цитометрия.

Клетките на стромалната съдова фракция (SVF) се събират, както е описано по-рано (30). За поточна цитометрия 1 милион клетки бяха инкубирани в Fc блок за 5 минути, последвано от 30-минутна инкубация при 4 ° C с конюгирани с флуорофор антитела: F4/80-алофикоцианин (APC), CD11c-фикоеритрин (PE) от eBioscience, Сан Диего, Калифорния), CD11b-APC – Cy7, T-клетъчен рецептор-β (TCR-β) –APC, CD4-A700, CD8-PE – Cy7, CD62L-PE и CD44-FITC (всички от BD Biosciences, Сан Хосе, Калифорния). DAPI (0.2 mg/mL) се добавя като жизнено оцветяване преди да се извърши поточна цитометрия. Пробите бяха обработени на пет лазерен LSRII поточен цитометър в ядрото на поточната цитометрия на университета Vanderbilt. Данните бяха анализирани с помощта на софтуера FlowJo (Tree Star, Ashland, OR). Стратегията за анализиране на съдържанието на ATM и Т-клетките е обяснена в допълнителна фигура 1. В целия ръкопис данните за поточната цитометрия се показват като процент на положителни флуорофорни клетки спрямо общия брой живи клетки. Флуоресценцията минус един контролен субект за ATM и AT Т-клетъчен анализ са показани на допълнителни фигури. 2 и 3, а изотипните контроли както за ATM, така и за AT Т-клетъчни маркери са представени на допълнителна фиг. 4.

Статистика.

За всички статистически анализи е използван софтуерът Prism 5.0 (GraphPad). Данните бяха анализирани с помощта на еднопосочен ANOVA, последван от post hoc тест на Student t, ако ANOVA беше значим. За сравняване на измерванията с две различни променливи е използвана двупосочна ANOVA. Отклоненията бяха изключени от данните за всеки отделен параметър с помощта на теста на Grubbs outlier (31). Стойността на Р ≤ 0,05 се счита за значима.

РЕЗУЛТАТИ

Уча дизайн.

За да се определи дали колоезденето с тегло променя метаболитните параметри или популациите от имунни клетки, мъжките мишки C57Bl/6 са хранени с диети, за да предизвикат редуващи се затлъстели и слаби състояния. Изследването се състои от три 9-седмични диетични периода, в които мишките имат либитум достъп до 10% LFD или 60% HFD. Използвани са три групи мишки (фиг. 1А). Слабата контролна група (обозначена с LF/LF/LF на фигури) беше поставена върху LFD за времето на проучването (27 седмици). Групата за наддаване на тегло (обозначена с LF/HF/HF на фигури) се поддържа на LFD в продължение на 9 седмици и след това се преминава към HFD през останалите 18 седмици от проучването. Групата за колоездене на тегло (обозначена с HF/LF/HF на фигури) се поставя върху HFD за 9 седмици, за да предизвика затлъстяване и инфилтрация на имунни клетки в AT, превключва се на LFD за 9 седмици, за да се насърчи загубата на тегло, и се поставя върху HFD през последния 9-седмичен период за предизвикване на последващо затлъстяване.

Циклирането на тегло увеличава експресията на AT гена на Т-клетъчни маркери и CD4 + Th1 и CD8 + Т-клетъчни цитокини. РНК се изолира от епидидималната АТ и генната експресия се анализира чрез RT-PCR в реално време. A: Cd3. B: Cd4. C: Cd8. D: Ifng. Д: Il12. F: Il2. G: Il2ra. H: Il2rb. I: Ccl5. Данните са представени като средно ± SEM; n = 8-14/група. Групите, които не са свързани с една и съща буква, са значително различни; Цитокини, получени от P + Th1- и CD8 + Т клетки в AT.

След това определихме експресията на гени, свързани с функцията на Т-клетките и възпалителния статус. Th1-поляризираните CD4 + Т клетки и цитотоксичните CD8 + Т клетки секретират високи нива на възпалителния цитокин IFN-γ (36). RT-PCR анализът в реално време показва, че циклирането с тегло допълнително увеличава индуцираното от HFD увеличаване на експресията на гена Ifng (фиг. 6D) (P + T клетки (38), е увеличено два пъти в сравнение с групата за увеличаване на теглото (фиг. 6F ) (P + ефекторна памет натрупване на Т-клетки в AT.

Една от отличителните черти на адаптивния имунен отговор е развитието на клетъчна памет срещу специфични антигени (39). За да се определи дали цикличността на теглото е свързана с увеличаване на ефекторната памет Т клетки, CD4 + и CD8 + Т клетки са анализирани за CD62L и CD44. Т4 клетките на ефекторната памет на CD4 + (CD62L - CD44 +) не са модулирани нито чрез HFD хранене, нито чрез циклично тегло (Фиг. 7A-D). Въпреки това, в съгласие с публикуваната литература (10,11), затлъстяването увеличи броя на CD8 + ефекторните Т клетки в AT (фиг. 7Е и F) (P + ефекторно натрупване на Т-клетки в AT на мишки с циклично тегло) Фигура 7F и G) (P = 0,075 в сравнение с LF/HF/HF). Горните данни показват, че Т-клетките на ефекторната памет се натрупват в AT по време на затлъстяване и че цикличността на теглото може допълнително да увеличи този адаптивен отговор на имунната памет.

Повишено CD8 +, но не CD4 +, натрупване на ефекторна памет в Т-клетки в AT по време на затлъстяване. SVF клетки бяха изолирани от епидидималния AT и анализирани чрез поточна цитометрия. A и E: LF/LF/LF (постно управление) група. B и F: LF/HF/HF (наддаване на тегло) група. C и G: група HF/LF/HF (колоездене с тегло). Клетките бяха затворени за популацията на лимфоцитите въз основа на разсейване напред и отстрани (допълнителна фигура 1), избрани за експресия на CD4 (A – D) или CD8 (E – H) (фиг. 5) и след това анализирани за памет T- клетъчни маркери. Представителни графики на поточна цитометрия на CD4 + клетки, анализирани за CD62L и CD44 (A – C). D: Количествено определяне на CD4 + ефекторни Т клетки (CD62L - CD44 +) чрез поточна цитометрия. Представителни графики на поточна цитометрия на CD8 + клетки, анализирани за CD62L и CD44 (E – G). H: Количествено определяне на CD8 + ефекторни Т клетки (CD62L - CD44 +) чрез поточна цитометрия. Данните са представени като средно ± SEM; n = 6–12/група. Групите, които не са свързани с една и съща буква, са значително различни; Р + Т клетки, CD4 + Т клетки и експресията на цитокини, получени от Th1 клетки в AT на мишки, циклирани с тегло. Тези нови открития предполагат, че се увеличава Т-клетъчен отговор при AT по време на циклично тегло.

Предишни доклади показват, че колоезденето с тегло увеличава системния IR при плъхове (40,41), а скорошно проучване показва повишени нива на възпалителния цитокин в AT на мишки, циклирани с тегло, в сравнение с мишки с постно управление (42). Многобройни проучвания при хора показват, че колоезденето с тегло увеличава риска от развитие на сърдечно-съдови заболявания и диабет тип 2 (23–27). Едно от първите проучвания, посветени на този проблем, отчита 10% увеличение на 25-годишния риск от коронарна смърт при мъже, които са с циклично тегло в сравнение с тези, които са наддали, но са останали стабилни (24). Освен това, скорошно проучване показа, че колоезденето с тегло е свързано с повишена честота на диабет тип 2 при участниците в проучването на Framingham Heart Study (23).

За разлика от горните констатации, други проучвания не съобщават за неблагоприятни ефекти от колоезденето с тегло (19–22). Противоречието относно въздействието на колоезденето при хора с тегло може да се дължи отчасти на вариабилността на дизайна на изследването. Важно е, че нашите данни предполагат, че преувеличеният адаптивен имунен отговор при AT може да допринесе за негативните ефекти от колоезденето с тегло. В действителност, CD4 + Th1 и Th2 и CD8 + Т клетки са известни, че играят роля в патогенезата на човешкото затлъстяване (43). Следователно, ако степента на циклично тегло или времето между циклите (както е определено от плана на изследването) не са били достатъчни, за да предизвикат инфилтрация на AT имунни клетки, ефектът на циклично тегло върху метаболизма може да не е бил наблюдаван.

Важно е да се потвърди, че загубата на тегло напълно обръща свързаната със затлъстяването метаболитна дисфункция преди последващото наддаване на тегло. Метаболитното фенотипизиране, проведено на 18-та седмица от проучването, демонстрира, че когато мишките от групата, които карат тегло, преминават на LFD, те отслабват и точно се нормализират спрямо телесното тегло/състав и глюкозен толеранс на мишки, поддържани на LFD за продължителност на проучването (допълнителна фигура 5). Тези данни показват, че непоносимостта към глюкоза не предхожда възстановяването на теглото по време на този протокол за циклично тегло и предполагат, че цикличността на теглото сама по себе си е отговорна за метаболитната дисфункция, наблюдавана в края на проучването.

В това проучване ние демонстрираме, че колоезденето с тегло увеличава натрупването на CD4 + и CD8 + Т клетки в AT. Освен това, генната експресия на Th1-получени цитокини и цитокинови рецептори се увеличава в AT на мишки, циклирани с тегло, в сравнение с мишки, поддържани на HFD (Фиг. 6). Последните проучвания показват, че мишките, които нямат определени Т-клетъчни цитокини или проинфламаторни Т-клетъчни подгрупи, са защитени от много от патологиите, свързани със затлъстяването. Например, HFD-индуцирана глюкозна непоносимост и AT възпаление се подобрява при IFN-y-нокаутиращи мишки (44). Освен това делецията на CD8 + Т клетки подобрява системния глюкозен толеранс и инсулиновата чувствителност (14). Освен това, нокаутирането на T-bet намалява множеството популации на лимфоцитни клетки в рамките на AT и подобрява индуцираната от HFD глюкозна непоносимост и възпаление на AT (45). Тези публикувани проучвания показват, че повишеното Т-клетъчно възпаление при AT може да допринесе за нарушената AT инсулинова чувствителност и системната непоносимост към глюкоза, наблюдавани по време на циклично тегло.

В допълнение, ние направихме регресионен анализ, за ​​да определим дали има връзка между съдържанието на AT Т-клетки и толеранса към глюкоза при мишките в нашето проучване. Тези анализи показват, че нарушената глюкозна толерантност (увеличена площ под кривата на GTT) е значително и положително корелирана с процента на CD4 + и CD8 + Т клетки в AT, както и с генната експресия на Th1-получените цитокини Ifng и Il2 (Допълнителна фиг. 9). Освен това, когато тези корелации бяха коригирани за промени в броя на ATM, връзката между нарушен глюкозен толеранс и AT T-клетъчен брой остава значителна (CD4, P = 0,002; CD8, P = 0,01). Следователно тези констатации затвърждават заключението, че увеличаването на възпалителните Т-клетъчни подгрупи, но не и на макрофагите, в АТ допринася за нарушена метаболитна годност по време на колоездене.

IR при AT е ключов фактор за системната непоносимост към глюкоза по време на затлъстяване; други метаболитни тъкани обаче също играят важна роля за поддържане на глюкозната хомеостаза. Идеалният метод за определяне на тъканно-специфични нарушения в инсулиновата сигнализация е хиперинсулинемично-евгликемичната метаболитна скоба. Въпреки това, поради напредналата възраст на мишките в края на настоящото проучване, ние избрахме да не извършваме тези изследвания. Вместо това оценихме сигналните пътища в различни тъкани след болусна инжекция на инсулин. Както е показано на допълнителна фигура 6, колоезденето с тежести също уврежда чернодробната, но не мускулната инсулинова сигнализация. Поради това е вероятно променената чернодробна чувствителност към инсулин, в допълнение към имунометаболитните промени в AT, да допринесе за системната метаболитна дисфункция, наблюдавана по време на цикъла на теглото. Докато настоящият ни доклад се фокусира върху AT имунен състав и IR, въздействието на цикличното тегло върху черния дроб е важна област на бъдещото разследване.

Взети заедно, нашите проучвания показват за първи път, че колоезденето с тегло модулира състава на Т-клетките, но не и макрофагите. Това увеличение на проинфламаторните Т-клетъчни популации предполага, че преувеличеният адаптивен имунен отговор при АТ допринася за негативните метаболитни последици от колоезденето с тегло.

ПРИЗНАВАНИЯ

Този проект е финансиран от Националния здравен институт Grant HL-089466. А.Х.Х. също беше подкрепена от награда за кариерно развитие на Американската асоциация за диабет (1-07-CD-10) и награда на Американската асоциация за сърдечни заболявания (12EIA827). E.K.A. беше подкрепена от Програмата за обучение на клетъчни, биохимични и молекулярни науки (Национален институт по здравеопазване Grant T32-GM-008554) и докторантска стипендия на Американската асоциация по сърдечни заболявания (12PRE11910047). D.A.G. беше подкрепена от индивидуална награда на Националната служба за научни изследвания (DK-091128) и A.K. е финансиран от Американска асоциация за диабет Постдокторантска стипендия (7-10-MI-05). Експерименти с поточна цитометрия бяха проведени в Центъра за медицински потоци на Университета Вандербилт, споделени ресурси, подкрепени от Центъра за изследване на храносмилателната болест на Вандербилт (DK-058404).

Не са докладвани потенциални конфликти на интереси, свързани с тази статия.

E.K.A. събра и анализира данните и написа ръкописа. D.A.G. и А.К. съдейства за събирането на данни и прегледа ръкописа. А.Х.Х. осигури финансиране, подпомогна анализа на данните и редактира ръкописа. А.Х.Х. е гарант за тази работа и като такъв е имал пълен достъп до всички данни в проучването и поема отговорност за целостта на данните и точността на анализа на данните.

Авторите благодарят на членовете на своята лаборатория за внимателното четене на този ръкопис. Авторите също благодарят на д-р. Аюми Шитанти и Айхуа Биан (Университет Вандербилт) за статистическа помощ. Те се поддържат от грантовете на NIH AR-056116, DK-020593-33.