От Катедрата по физиология, развитие и неврология, Университет в Кеймбридж, Обединено кралство (Y.N., A.D.K., C.M.L., B.J.A., Y.Y.C., R.N.-D., D.A.G.)

Инициатива за стратегическо изследване на сърдечно-съдовата система в Кеймбридж (YN, S.E.O., D.A.G.).

От Катедрата по физиология, развитие и неврология, Университет в Кеймбридж, Обединено кралство (Y.N., A.D.K., C.M.L., B.J.A., Y.Y.C., R.N.-D., D.A.G.)

От Катедрата по физиология, развитие и неврология, Университет в Кеймбридж, Обединено кралство (Y.N., A.D.K., C.M.L., B.J.A., Y.Y.C., R.N.-D., D.A.G.)

От Катедрата по физиология, развитие и неврология, Университет в Кеймбридж, Обединено кралство (Y.N., A.D.K., C.M.L., B.J.A., Y.Y.C., R.N.-D., D.A.G.)

От Катедрата по физиология, развитие и неврология, Университет в Кеймбридж, Обединено кралство (Y.N., A.D.K., C.M.L., B.J.A., Y.Y.C., R.N.-D., D.A.G.)

Университетски медицински център, Утрехт, Холандия (J.J.K., J.B.D.)

От Катедрата по физиология, развитие и неврология, Университет в Кеймбридж, Обединено кралство (Y.N., A.D.K., C.M.L., B.J.A., Y.Y.C., R.N.-D., D.A.G.)

Университет в Кеймбридж Метаболитни изследователски лаборатории и Съвет за медицински изследвания, Отдел за метаболитни болести, Институт по метаболитни науки, болница Addenbrooke’s, Кеймбридж, Великобритания (T.J.A., H.L.B., S.E.O.)

Университет в Кеймбридж Метаболитни изследователски лаборатории и Съвет за медицински изследвания, Отдел за метаболитни болести, Институт по метаболитни науки, болница Addenbrooke’s, Кеймбридж, Великобритания (T.J.A., H.L.B., S.E.O.)

Университетски медицински център, Утрехт, Холандия (J.J.K., J.B.D.)

Университет в Кеймбридж Метаболитни изследователски лаборатории и Съвет за медицински изследвания, Отдел за метаболитни болести, Институт по метаболитни науки, болница Addenbrooke’s, Кеймбридж, Великобритания (T.J.A., H.L.B., S.E.O.)

Инициатива за стратегическо изследване на сърдечно-съдовата система в Кеймбридж (YN, S.E.O., D.A.G.).

Кореспонденция на Дино А. Джусани, Катедра по физиология, развитие и неврология, Университет в Кеймбридж, ул. Даунинг, Кеймбридж, CB2 3EG, Великобритания. електронна поща

От Катедрата по физиология, развитие и неврология, Университет в Кеймбридж, Обединено кралство (Y.N., A.D.K., C.M.L., B.J.A., Y.Y.C., R.N.-D., D.A.G.)

Инициатива за стратегическо изследване на сърдечно-съдовата система в Кеймбридж (YN, S.E.O., D.A.G.).

Резюме

Алтернативна антиоксидантна стратегия с подобрена транслационна стойност на клиничната терапия при хора може да бъде инхибиторът на ксантиноксидазата алопуринол. Хипоксията води до увеличаване на генерираните от ксантин оксидаза свободни радикали 11, а при хората лечението на майката с алопуринол преминава през плацентата, 12 което оправдава този начин на приложение за превантивна терапия в акушерската практика. Предполага се, че алопуринолът има благоприятни ефекти при намаляване на увреждането на исхемия-реперфузия (IR) в кардиологията на възрастни и в детската и възрастната кардиоторакална хирургия. 13,14 В действителност, лечението с майки с алопуринол понастоящем се обмисля в клинични изпитвания при хора, за да се предпази новороденото бебе от причинено от оксидативен стрес нараняване по време на бременност, усложнена от фетална хипоксия. 15

Методи

Декларация за разкриване на данни, материали и код

Данните, които подкрепят констатациите от това проучване, са достъпни от съответния автор при разумно искане.

Етично одобрение

Това изследване е одобрено съгласно Закона за животните (научни процедури) от 1986 г. Регламент за изменение 2012 г. след етичен преглед от Съвета по хуманно отношение към животните и етичен преглед на Университета в Кеймбридж.

Животни

Плъховете Wistar (Charles River, Ltd, Margate, Обединеното кралство) бяха настанени индивидуално във вентилирани клетки при стандартни условия със свободен достъп до храна (Special Diet Services, Великобритания) и вода. След 10 дни аклиматизация, девствените женски (n = 56, 10-12-седмична възраст) бяха сдвоени с плодови мъжки плъхове (минимум 12-седмична възраст). Наличието на копулаторен щепсел се счита за ден 0 от бременността (срокът е около 21 дни).

Хипоксична бременност и лечение с алопуринол при майките

Подготовка за сърце на Лангендорф

Сърдечно стимулирана функция: агонисти и IR предизвикателство

Сърдечната реакция към мускариновия агонист Carbachol (карбамилхолин хлорид, Sigma-Aldrich, Co, Ltd, Poole, Великобритания; диапазон, 10 -10 -10 -6 mol/L) и β1-адренорецепторния агонист изопреналин ([-] - изопреналин [+] - битартратна сол, Sigma-Aldrich, Co, Ltd, Poole, Обединеното кралство; диапазон, 10 -11 -10 -7 mol/L) бяха изследвани, както е описано по-горе. 22 След последния отговор на дозата, когато сърдечната честота и LVDP се възстановят обратно до изходното ниво, сърцата са подложени на IR предизвикателство, съставено от 10 минути глобална исхемия чрез спиране на перфузията, последвано от 30 минути реперфузия.

CK и LDH активност

Коронарният отток (2 ml) се събира преди исхемия (-15 минути) и в началото на реперфузията (0 минути). Пробите незабавно се замразяват в течен азот и се държат при -80 ° C до анализ. Активността на перфузат CK се анализира, като се използва анализ на бихроматично свързана ензимна реакция (анализатор Siemens Dimension RxL, Malvern, PA). Активността на перфузат LDH беше анализирана с помощта на колориметричен анализ (анализатор Siemens Dimension RxL, Malvern, PA).

Експресия на сърдечен протеин

На 4-месечна възраст сърцето от мъжки брат или сестра от всяко кучило беше изолирано, замразено в течен азот и поддържано при -80 ° C. Експресията на протеин на сърдечния β1-адренергичен рецептор, M2 Ach рецептора и SERCA2a се определя чрез Western blot; 23 10 µg протеин бяха заредени за всяка проба. Равното протеиново натоварване беше потвърдено чрез оцветяване в синьо Coomassie. Използваните антитела са β1-адренергичен рецептор (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX), M2 Ach рецептор (Abcam, Кеймбридж, Обединено кралство) и сърдечната SERCA2a, Cell Signaling, Danvers, MA). Свързано второ антитяло от хрян, свързано с пероксидаза (Jackson ImmunoResearch), беше открито с помощта на Super15 Signal West Pico Chemiluminescent substrat (Thermo Scientific, Великобритания). Авторадиографираните изображения бяха количествено определени с помощта на AlphaEase (Alpha Innotech).

Статистически анализ

Извършени бяха подходящи изчисления на мощността, получени от предишни набори от данни, за да се определи минималният размер на извадката, необходим за постигане на статистическа значимост, зададена на P

майчин

Фигура 1. Сърдечна базална функция. Стойностите са графични точки, както и средна стойност ± SEM. Групите са нормоксични (N; n = 9), хипоксични (H; n = 8), хипоксични, лекувани с алопуринол (HA; n = 8), и нормоксични, лекувани с алопуринол (NA; n = 9) бременност. Значителни разлики (P

Сърдечни отговори към автономни агонисти

Сърца на възрастни мъжки потомци с нормоксична бременност показват дозозависими хронотропни (сърдечна честота) и инотропни (LVDP) отговори на агонисти (Таблица S1 в онлайн само притурката за данни). Възрастни мъжки потомци с хипоксична бременност показват намалени сърдечни отрицателни хронотропни и инотропни отговори на карбахол, докато значително подобрени положителни хронотропни и инотропни отговори на изопреналин (Таблица S1). Следователно съотношението на максималните отговори на изопреналин спрямо тези на карбахола беше значително увеличено (Фигура 2). Сърцата на възрастни мъжки потомци с хипоксична бременност, лекувани с алопуринол, вече не показват тези ефекти (Таблица S1 и Фигура 2). Сърцата на възрастни мъжки потомци на нормоксична бременност, лекувани с алопуринол, показват нарушен инотропен отговор на карбахол (Таблица S1).

Фигура 2. Сърдечно симпатично доминиране. Стойностите са графични точки, както и средната стойност ± SEM за съотношението на сърдечните хронотропни и инотропни реакции към изопреналин и карбахол. Групите са нормоксични (N; n = 9), хипоксични (H; n = 8), хипоксични, лекувани с алопуринол (HA; n = 8), и нормоксични, лекувани с алопуринол (NA; n = 9) бременност. Значителни разлики (P

Предизвикателство за исхемия/реперфузия

Възрастни мъжки потомци с хипоксична бременност показват нарушено сърдечно възстановяване до IR (Фигура 3A) и повишени нива на CK и LDH отток (Фигура 3B и 3C) в началото на реперфузията. Възрастни мъжки потомци с хипоксична бременност, лекувани с алопуринол, показват възстановен сърдечен възстановителен отговор на IR и нормализирани CK и LDH (Фигура 3А до 3С).

Фигура 3. Предизвикателство за сърдечна исхемия и реперфузия. Стойностите са графични точки или средно ± SEM за сърдечната реакция на развитото налягане в лявата камера (LVDP) на исхемия-реперфузия и нивата на CK (креатин киназа) и LDH (лактат дехидрогеназа). Групите са нормоксични (N; n = 9), хипоксични (H; n = 8), хипоксични, лекувани с алопуринол (HA; n = 8), и нормоксични, лекувани с алопуринол (NA; n = 9) бременност. Значителни разлики (P

Експресия на сърдечен протеин

Възрастни мъжки потомци с хипоксична бременност показват повишена експресия на сърдечен протеин на SERCA2a без никакви значими ефекти върху експресията на β1-адренергичен или мускаринов тип 2 рецептори (Фигура 4А до 4С). Възрастни мъжки потомци с хипоксична бременност, лекувани с алопуринол, показват възстановена експресия на сърдечен протеин на SERCA2a (Фигура 4А). Възрастни мъжки потомци на нормоксична бременност, лекувани с алопуринол, показват засилена експресия на сърдечен протеин на SERCA2a спрямо сърцата на възрастни мъжки потомци на нелекувана нормоксична бременност (Фигура 4А) без ефекти върху протеиновата експресия на β1-адренергични или мускаринови рецептори тип 2.

Фигура 4. Експресия на сърдечни протеини. Стойностите са графични точки, както и средна стойност ± SEM. Групите са нормоксични (N; n = 6), хипоксични (H; n = 6), хипоксични, лекувани с алопуринол (HA; n = 6), и нормоксични, лекувани с алопуринол (NA; n = 6) бременност. Значителни разлики (P 2+ ATPase 2a.

Характеристики на бременността и биометрия на потомството

Стойностите за продължителността на бременността, размера на котилото и за съотношението мъже към жени не се различават между групите (Таблица). Хипоксичната бременност не е повлияла теглото при раждане или симетрията на растежа на тялото. В сравнение с нормоксичната бременност, сърцата на възрастни мъжки потомци с хипоксична бременност са с подобно тегло, но абсолютното тегло на лявата камера е намалено (Таблица). Алопуринолът при майката при хипоксична бременност не повлиява характеристиките на бременността или биометрията на мъжкото потомство и не възстановява намаляването на абсолютното тегло на LV, измерено при възрастни мъжки потомци на нелекувана хипоксична бременност (Таблица). Лечението на майката с алопуринол при нормоксична бременност не е имало ефект (Таблица).

Таблица. Характеристики на бременността и биометрия на потомството

Стойностите са средни ± SEM за променливите на майката и потомството. Групите са N (n = 10-17), H (n = 8-21), HA (n = 8-22) и (NA, n = 10-17) бременност. абс показва абсолютно тегло; CRL, дължина на короната на кръста; Н, хипоксичен; HA, хипоксично третирана с алопуринол; LV, лява камера; N, нормоксичен; NA, нормоксичен, третиран с алопуринол; PI, пондерален индекс (телесно тегло. [CRL 3] -1); rel, относително тегло; и RV, дясна камера.

* Значителни разлики (P 2+ управление. Дейностите на CK и LDH в коронарния перфузат след IR при възрастни мъжки потомци с хипоксична бременност също бяха повишени, като по този начин свързваха молекулярните маркери за сърдечен стрес и нараняване с повишената сърдечна чувствителност към IR увреждане (Фигура 5).

Фигура 5. Резюме на основните констатации. Програми за хипоксична бременност, сърдечна дисфункция при възрастни мъжки потомци. Включените механизми включват повишаване на ксантиноксидазата, сърдечно-симпатикова доминация и променена сърдечна калциева биология. Лечението на майката с инхибитор на ксантиноксидазата, алопуринол, предотвратява програмираната сърдечна дисфункция при възрастни мъжки потомци, нормализира сърдечно-симпатиковата доминация и променя сърдечната калциева биология. Следователно, оксидативният стрес, получен от ксантиноксидаза, играе важна роля в програмирането на сърдечна дисфункция чрез хипоксия на развитието. Лечението на майката с алопуринол трябва да се разглежда като клинична намеса срещу програмирането на сърдечни заболявания при възрастни потомци на високорискова бременност при хората. IR показва исхемия-реперфузия; LV, лява камера; ROS, реактивни кислородни видове; и SERCA2a, саркоплазмен ретикулум Ca2 + ATPase 2a.

Допълнителни данни в настоящото проучване показват повишено симпатиково доминиране в сърцата на мъжкото потомство с хипоксична бременност. Повишаването на нивата на сърдечен протеин на SERCA2a при потомци от хипоксична бременност може отново да бъде включено в този програмиран отговор, тъй като SERCA2a насърчава повишаване на сърдечната контрактилитет и стимулиране на сърдечните β-адренергични рецептори фосфорилати и инактивира фосфоламбан, инхибитор на SERCA. 28 Повишеното сърдечно-симпатиково доминиране е част от компенсаторния невроендокринен механизъм за увеличаване на контрактилитета на миокарда и поддържане на сърдечния дебит при младите възрастни потомци на хипоксична бременност. Такива компенсаторни реакции обаче могат да станат декомпенсирани по-късно в живота, тъй като трайното нарастване на симпатиковата доминация и контрактилитета на миокарда са неустойчиви, което води до вредни ефекти върху сърдечната функция и в крайна сметка води до сърдечна недостатъчност. 29,30

Намаляването на базалния коронарен поток е свързано с повишен риск от сърдечно увреждане в отговор на IR. 30,31 В съответствие с това твърдение, сърцата на възрастни мъжки потомци с хипоксична бременност са имали нарушено възстановяване на IR и повишени LDH и CK в коронарния отток след исхемия. LDH участва в метаболизма на глюкозата и катализира взаимното превръщане на лактат и пируват, докато СК катализира превръщането на креатина във фосфокреатин, отговорен за трансфера и използването на АТФ. Когато кардиомиоцитите са повредени, LDH и CK се освобождават от цитоплазмата в кръвта, ефект, който е клинично използван като установени биомаркери за сърдечно увреждане. 7,31 Повишаването на нивата на отпадъчните води на LDH и CK непосредствено след исхемия е следователно сериозно доказателство за повишен риск от IR увреждане в сърцата на потомството от хипоксична бременност.

Перспективи

Хипоксия в развитието, най-честият резултат при неблагоприятни човешки програми за бременност, повишен риск от сърдечни заболявания при възрастното потомство. Използвайки утвърден модел на гризачи, тук показваме, че оксидативният стрес, получен от ксантин оксидаза, свързва хипоксията на развитието със сърдечна дисфункция и с молекулярни механизми на сърдечен стрес и нараняване при възрастните потомци. В допълнение, лечението на майката с алопуринол е защитно. Следователно, целенасоченото инхибиране на оксидативния стрес, получен от ксантин оксидаза, може да предложи подобрена транслационна стойност за клиничната терапия при хора, за да се предотврати програмирането на сърдечна дисфункция при потомци с високорискова бременност.

Източници на финансиране

Това проучване беше подкрепено от Британската фондация за сърце, Лондон, Великобритания. Д. Джусани е професор по развитие на сърдечно-съдовата физиология и медицина в Катедрата по физиология, развитие и неврология в Университета в Кеймбридж, професор и директор по изследвания в медицината в колежа Гонвил и Кай, член на Института Листър и Кралско общество Носител на наградата за научни заслуги на Wolfson.