Свързани данни

Резюме

Обосновка: Като най-малките свободно живеещи бактерии и честа причина за респираторни инфекции, микоплазмите са уникални патогени. Мишките, заразени с Mycoplasma pulmonis, могат да развият локализирана, през целия живот инфекция на дихателните пътища, придружена от постоянно възпаление и ремоделиране.

Цел: Тъй като мастоцитите предпазват мишките от остър септичен перитонит и грам-отрицателна пневмония, предположихме, че те се защитават срещу микоплазмена инфекция. Това проучване тества тази хипотеза, използвайки мишки с дефицит на мастоцити.

Методи: Отговорите на инфекция на дихателните пътища с M. pulmonis бяха сравнени при мишки Kit W-sh/Kit W-sh с дефицит на мастни клетки и мишки, инфектирани контролни мишки.

Измервания и основни резултати: Крайните точки включват смъртност, тегло на тялото и лимфните възли, титър на микоплазмените антитела и натоварване на белите дробове и хистопатология на интервали след инфекция. Резултатите разкриват, че заразените Kit W-sh/Kit W-sh мишки, в сравнение с други групи, губят повече тегло и е по-вероятно да умрат. Натоварването с жива микоплазма е по-голямо при Kit W-sh/Kit W-sh, отколкото при мишки от див тип в ранните моменти от времето. Четири дни след инфекцията разликата е 162 пъти. Титрите на специфичните за микоплазма IgM и IgA се появяват по-рано и се покачват по-високо при Kit W-sh/Kit W-sh мишки, но отговорите на антителата към топлоубитата микоплазма не са различни в сравнение с мишки от див тип. Инфектираните Kit W-sh/Kit W-sh мишки развиват по-големи бронхиални лимфни възли и прогресивна пневмония и запушване на дихателните пътища с богати на неутрофили ексудати, придружени от ангиогенеза и лимфангиогенеза. При мишки от див тип пневмонията и ексудатите са по-малко тежки, по-бързо се разрешават и не са свързани с повишена ангиогенеза.

Заключения: Тези открития предполагат, че мастоцитите са важни за вроденото сдържане на имунната система и възстановяването от инфекция на дихателната микоплазма.

Микоплазмите са най-малките свободно живеещи, самовъзпроизвеждащи се бактерии и притежават необичайно малки геноми (прегледани в справка 14). Те се различават по ключови начини от другите микроби, включително липсата на клетъчна стена. Микоплазмите са предимно лигавични патогени, живеещи като извънклетъчни паразити в тясна връзка с епителните клетки на гостоприемника, обикновено в дихателните и урогениталните пътища. Mycoplasma pneumoniae е водеща причина за детски и възрастни трахеобронхит и пневмония. Инфекцията с микоплазмени заболявания може да влоши или дори да ускори неинфекциозни респираторни заболявания, като астма и хронична обструктивна белодробна болест, при хора (15, 16) и при модели на гризачи (17, 18). Много микоплазми, заразяващи хора и други бозайници, са известни със способността си да предизвикват хронично заболяване, при което изчистването на организма е трудно (14). Това е отчасти защото микоплазмите могат да избегнат имунното разпознаване, като променят репертоара си на повърхностни антигени. Някои микоплазми избягват имунното наблюдение, живеейки в клетките на гостоприемника (19). Те също така могат да модулират имунната реакция на гостоприемника и да установят постоянна инфекция. Mycoplasma pulmonis причинява естествено миши респираторно заболяване с прояви, подобни на тези при хора с инфекция с M. pneumoniae (17, 20).

Ние предположихме, че тъй като белодробните мастоцити помагат да се защитават срещу остри инфекции с някои конвенционални бактерии, те също защитават срещу остра и хронична микоплазмена инфекция. Освен това, тъй като мастоцитите насърчават някои видове ангиогенеза и стимулират ремоделирането на дихателните пътища при хронично алергично възпаление (21–23), предположихме, че те допринасят за ремоделиране, индуцирано от микоплазма (20, 24). За да тестваме тези хипотези, сравнихме отговорите на дихателните пътища към M. pulmonis при мишки с дефицит от див тип и мастоцити. Някои от тези резултати са докладвани под формата на резюме (25).

МЕТОДИ

Микоплазмена инфекция

Мишките с дефицит на мастоцитни клетки C57BL/6 Kit W-sh/Kit W-sh (Wsh) и мишки от див тип C57BL/6 Kit +/Kit + (+/+) бяха настанени, както е описано (26) и изследвани при 8 до 10 wk на възраст, с изключение на експерименти с осиновяващи трансфери, при които мишките са били заразени на възраст от 17 до 18 wk. Мишките бяха инокулирани интраназално с 5 × 10 5 cfu от M. pulmonis щам CT7 (27). Тази доза е установена чрез пилотни проучвания, които откриват висока смъртност при Wsh мишки с по-големи инокулати. Избраните мишки получават по-малък инокулум (10 5 cfu). Контролните мишки получават стерилен бульон.

Брутни наблюдения и хистопатология

След заразяване мишките бяха убити на интервали до 28 d. Крайните точки включват заболеваемост, тегло на тялото и бронхиалните лимфни възли и тежест на пневмонията, както е оценено чрез хистопатологично оценяване (28).

Количествени култури на микоплазма

Хомогенатите на заразените бели дробове се разреждат последователно върху плочи от агар (17). Колониите са преброени след 7 до 10 дни.

Бронхоалвеоларен лаваж

Под анестезия стерилен катетър с 22 калибрира беше поставен в открития трахен лумен. Течност за бронхоалвеоларна промивка (BAL) се събира от три 0,8 ml аликвотни части от фосфатно буфериран физиологичен разтвор (PBS) на мишка. Супернатантите се съхраняват при -80 ° C.

Поточна цитометрия

Клетки, дезагрегирани от бронхиални лимфни възли, събрани 7 дни след инфекцията, бяха измити и инкубирани с конюгиран с флуоресцеин изотиоцианат анти-Mac-1 и CD69 (BD PharMingen, Сан Диего, Калифорния), конюгиран с фикоеритрин анти-CD8 и конюгиран с трицветна анти-CD4 и B220 (Caltag, Burlingame, Калифорния). Неспецифичното свързване беше блокирано с плъши анти-миши анти-CD16/32 (BD PharMingen). Клетките бяха анализирани с FACSCaliber поточен цитометър (Becton Dickinson, San Jose, CA).

Имунизация с топлинно убита микоплазма

М. pulmonis организми (0,5 × 106 или 20 × 106), убити при излагане на 65 ° С за 30 минути, се инжектират интраперитонеално в Wsh и +/+ мишки. Серумът е събран до 28 дни по-късно.

Измерване на антимикоплазма имуноглобулини

Имуноанализните плаки, покрити с M. pulmonis антиген (2 х 105 cfu/гнездо в 50 тМ карбонатен буфер, рН 9.6) се инкубират една нощ при 4 ° С. Кладенците бяха блокирани за 2 часа с 1% говежди серумен албумин (BSA)/PBS. Серум, разреден първоначално 1:20 (за IgG1 и IgG2a), 1:10 (IgA и IgM) и 1: 5 или неразреден (IgE), а след това серийно с PBS/0,05% Tween-20/0,5% BSA, последвано от 50 μl PharMingen биотинилиран антимиши IgG1, IgG2a, IgA, IgM или IgE (1: 2000). След инкубация през нощта, 50 μl конюгиран с алкална фосфатаза стрептавидин (1: 3 000; Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA) бяха добавени и детектирани спектрофотометрично при 405 nm, използвайки фосфатазен субстрат (Sigma, St. Louis, MO).

Измерване на хистамин

Концентрацията на хистамин в белодробните хомогенати се определя от Immunotech ELISA (Beckman Coulter, Fullerton, CA) съгласно инструкциите, предоставени от производителя.

Измерване на цитокини и повърхностноактивни протеини

Сигналите се определят количествено чрез денситометрия. Нивата на BAL цитокин и хемокин се изследват с ELISA комплекти за TNF-α, моноцитен хемоаттрактант протеин 1 (MCP-1) и интерлевкин (IL) -6 (BD PharMingen) и макрофаги възпалителен протеин 2 (MIP-2) (R&D Systems, Минеаполис, Минесота); тези протеини са избрани, защото те се секретират от мастоцитите и участват в отговорите на инфекцията. Повърхностноактивните протеини (SP) -A и SP-D колецини засилват фагоцитозата, регулират активността на макрофагите (29) и се свързват с M. pneumoniae (30). Сравнихме SP-A и SP-D при Wsh и +/+ мишки чрез точково имуноблотиране на серийно разредени BAL супернатанти. Anti-SP-A и anti-SP-D бяха инкубирани с петна, както е описано (31) и открити с конюгиран анти-заешки IgG, конюгиран с пероксидаза от хрян, чрез ECL (Amersham Pharmacia, Piscataway, NJ). Сигналите се определят количествено чрез денситометрия.

Култура на мастните клетки и осиновяване

Клетките на костния мозък на 5- до 7-неделни +/+ мишки бяха диференцирани в повече от 95% мастоцити за 4 до 5 седмици (3). Wsh мишките бяха инжектирани с опашка вена с 10 7 клетки и проучени 12 седмици по-късно въз основа на данни, че мастоцитите населяват Wsh белия дроб в рамките на 12 седмици след инжектирането (26).

Морфометрия на съдовете

Целите монтирани трахеи, изрязани след инфекция, бяха инкубирани с поликлонални анти-LYVE-1 и анти-миши CD31, за да маркират съответно лимфните и кръвоносните съдове (27). За трахеи, изрязани от контролни мишки, е пропуснато първично антитяло или е заместен неимунен серум. Плътностите на площта (процент от общата площ на тъканите) на LYVE-1– и CD31-положителни съдове във флуоресцентни изображения бяха измерени чрез стереологично преброяване на точки от 10 1,7-mm 2 области/трахея.

Статистически анализ

Данните бяха сравнени чрез t тест или еднопосочен дисперсионен анализ, с p Фигура 1), но Wsh мишките губят повече и им отнема повече време за възстановяване. С 16 d, +/+ мишките възстановяват загубеното тегло, докато Wsh не се възстановяват до изходното ниво с 28 d. Всъщност 3 от 22 заразени мишки Wsh (но без +/+) умряха. В краткосрочни експерименти Wsh мишки с паренхимни и малки популации от мастоцити на дихателните пътища, възстановени и увеличени чрез разтваряне, губят тегло по-бързо и е по-вероятно да умрат през първата седмица след получаване на 0,5 × 10 6 cfu микоплазма (вж. онлайн добавка). Въпреки това, възстановените от мастоцитни мишки, получаващи пет пъти по-малък инокулум, са загубили значително по-малко тегло от неконституираните мишки Wsh, изложени на подобен инокулум (p = 0,03; вижте фигура E1).

предпазват

Промяна на телесното тегло и смъртност след микоплазмена инфекция при Wsh и +/+ мишки. През първите 2 седмици заразените мишки Wsh губят постепенно повече тегло от заразените +/+ мишки. Три заразени мишки Wsh умряха в моменти, посочени от върховете на стрелките. След 2 седмици оцелелите заразени мишки Wsh започват да наддават на тегло. Данните са средни ± SEM; n = 5–21.

Бронхит и пневмония

За да изследваме тежестта на възпалението на дихателните пътища и белите дробове след инфекция, сравнихме резултатите от белодробната хистопатология и пневмония при Wsh и +/+ мишки. И двата типа мишки развиват неутрофилна пневмония 2 дни след инфекцията (Фигури 2A – 2F; вижте също Фигура E2). До 4 дни острото възпаление намалява в +/+, но не и Wsh. На 7 дни пневмонията прогресира при Wsh мишки, докато левкоцитните инфилтрати намаляват допълнително при +/+ мишки, като остатъчното възпаление е предимно перибронхиоларно и периваскуларно. Ексудатите на дихателните пътища са забележими при Wsh, но не и при +/+ мишките. До 14 дни прогресията на пневмонията и ексудатите при оцелелите мишки Wsh е тежка, докато +/+ мишките са значително възстановени, с разпръснати инфилтрати, които продължават и 28 дни, докато оцелелите мишки Wsh показват тежка организираща пневмония с дихателни пътища, останали задушени от възпалителни ексудати. Количественото оценяване (Фигура 2G) потвърждава тези впечатления. По този начин бронхитът и пневмонията са по-продължителни и тежки при Wsh от +/+ мишки.

Възпаление на белите дробове след микоплазмена инфекция при Wsh и +/+ мишки. (A – F) Микрография на бели дробове, събрани 2, 14 и 28 дни след експозиция на M. pulmonis (оцветени с хематоксилин и еозин). (G) Количествени резултати от пневмония на Wsh и +/+ мишки. Максималният възможен резултат е 26. Данните са средни ± SEM; п = 4-6; ** p Таблица 1). Wsh лимфните възли са два до четири пъти по-тежки от +/+ възлите 4 до 14 дни след инфекцията. Флуоресцентно-активиран клетъчен сортиращ анализ на лимфни възлови клетки на мишки, заразени в продължение на 7 дни, разкрива сходен общ брой на клетките при неинфектирани мишки Wsh и +/+, докато общият брой на заразените Wsh е 2,7 пъти по-висок от този при заразените +/+ мишки и почти пет пъти по-висока, отколкото при незаразените мишки. Неинфектираните мишки Wsh и +/+ имат сходни популации на бронхиални лимфни възли на CD4 + и CD8 + Т клетки и B220 + В клетки. Седем дни след инфекцията процентите на Т-клетките падат и на В-клетките се повишават при Wsh и +/+ мишки. Пропорциите на CD8 + клетки намаляват и при двете групи заразени мишки, но по-малко при Wsh мишки. По този начин лимфните възли при заразените мишки Wsh са подути с лимфоцити.

МАСА 1.

+/ + Неинфектирани 0 ТЕГЛО И НАСЕЛЕНИЯ НА КЛЕТОВИ БРОНХИАЛНИ ЛИМФНИ възли 7 d СЛЕД ИНФЕКЦИЯ С Mycoplasma pulmonis