Huimin Lu, Shan Lu, Dujiang Yang, Ling Zhang, Jun Ye, Mao Li, Weiming Hu; MiR-20a-5p регулира хемочувствителността на гемцитабин чрез насочване на RRM2 в раковите клетки на панкреаса и служи като предиктор за химиотерапия на базата на гемцитабин. Biosci Rep 1 май 2019; 39 (5): BSR20181374. doi: https://doi.org/10.1042/BSR20181374

чрез

Изтеглете файла с цитат:

Резюме

Рибонуклеотид редуктазната субединица M2 (RRM2) действа като важен ген, свързан с резистентност към гемцитабин при рак на панкреаса (PC). Тук имахме за цел да изследваме потенциалната микроРНК, която регулира хемочувствителността на гемцитабин чрез насочване към RRM2 и изследва клиничното значение на кандидат-miRNA в PC. MTT анализът и Western blot анализът разкриват, че продължителното лечение с гемцитабин в PC клетки предизвиква лекарствена резистентност и RRM2 се увеличава, а мълчанието на RRM2 блокира резистентността към гемцитабин. Сред предсказаните осем свързани с RRM2 микроРНК, експресията на miR-20a-5p показва най-значимото несъответствие между резистентни към гемцитабин клетки и родителски клетки. Освен това, генният анализ на двойна луцифераза показва, че miR-20a-5p директно насочва RRM2 3′UTR, като по този начин инхибира експресията на RRM2 и преодолява резистентността на гемцитабин на PC клетки. Ретроспективно проучване предполага, че плазменото ниво на miR-20a-5p е свързано с резистентността към гемцитабин при пациент с PC. ROC кривата показа, че изобилието от miR-20a-5p може да предскаже резистентност към гемцитабин с AUC от 89% (P

Въведение

Ракът на панкреаса (ПК) има най-високата смъртност от всички основни видове рак, като общата преживяемост е само приблизително 5%. Коефициентите на смъртност на PC в Китай показват приблизително 1,14-кратно нарастване, от 2,85/100 000 през 2003 г. до 3,26/100 000 през 2011 г., с годишна процентна промяна от 1,68 [1]. Химиотерапията е основното допълнително лечение за PC и в момента се използва гемцитабин. Но резистентността към гемцитабин е основна пречка за ефективната химиотерапия за компютър. Спешно е необходимо по-добро разбиране на молекулярния механизъм на PC резистентност срещу гемцитабин.

Рибонуклеотид редуктазата (RR) е ензим, който катализира образуването на дезоксирибонуклеотиди от рибонуклеотиди, критичният процес на клетъчна репликация [2]. Той е свръхекспресиран в редица солидни тумори, включително панкреаса [3]. Данните сочат, че RR играе положителна роля в пролиферацията и метастазите на туморни клетки, както и за развитието на резистентност към нуклеозидни аналози, използвани в химиотерапията с PC, включително гемцитабин [4]. RR се състои от α субединица, кодирана от Rrm1 и β субединица, кодирана от Rrm2. RRM1-RRM2 холоензимът осигурява dNTPs за репликация и възстановяване на S-фаза на nDNA в пролифериращи клетки. Експресията на RRM1 на високо ниво корелира с лоши отговори на гемцитабин, който директно е насочен към RRM1 [5]. Докато ниската експресия на RRM2 при рак на панкреаса предсказва по-голям отговор на гемцитабин [6]. Междувременно нокдаунът RRM2 също преодолява устойчивостта на цисплатин в култивирани клетки [7]. Доказано е, че експресията на RRM2 се индуцира в хеморезистентни клетки чрез генна амплификация, транскрипционно активиране и може би други неидентифицирани механизми [8]

Натрупващите се данни показват, че микроРНК (miRNAs) са участвали в патогенезата на PC. MiRNAs са малки, ендогенни, некодиращи RNA молекули, съдържащи 18–24 нуклеотида, които причиняват разграждане на mRNA или инхибират транслацията чрез свързване с комплементарни последователности в 3′-нетранслирания регион (3′-UTR) на техните целеви mRNAs [9]. miRNA регулирането на генната експресия играе важна роля в диференциацията на тъканите, клетъчната пролиферация, апоптоза и химиорезистентност [10,11]. В допълнение, устойчивостта към определени dNTP аналози е свързана с диференциална експресия на miRNA [12]. Въпреки това, ролята на miRNA в чувствителността на PC клетките към химиотерапията не е напълно изяснена и трябва да бъде допълнително проучена.

Следователно, за да проучим потенциалното взаимодействие между miRNA и RRM2 и за по-нататъшно проучване на възможността за използване на miRNAs за терапия на рак на панкреаса, ние се опитахме да определим прякото въздействие на осем свързани с RRM2 miRNAs, прогнозирани от TargetscanSites, picTarSites, RNA22Sites, PITASites или miRandaSites .org алгоритми за придобита резистентност към гемцитабин. Функцията на една драстично намалена miRNA, miR-20a-5p, в резистентност към гемцитабин е фокусирана върху последователно проучване.

Методи

Клетъчна култура

Клетъчната линия на човешкия рак на панкреаса MIA-PaCa2 и човешката ембрионална бъбречна клетъчна линия 293 (HEK293) са получени от American Type Culture Collection (ATCC). Резистентните към гемцитабин MIA-PaCa2 клетки (MIA-PaCa2-GEM) са избрани чрез непрекъснато третиране на MIA-PaCa2 клетки при нарастващи концентрации на гемцитабин, когато сливането на клетките достигне 40∼60%, което води до субклонове, устойчиви на 200 nM гемцитабин, както е описано [ 13]. Всички клетъчни линии са култивирани в DMEM (18 mmol/l глюкоза), допълнена с 10% FCS и 5% HEPES.

Данни за пациентите, плазма и тъкани

РНК усилване

Изолацията на РНК в плазмата и на култивираните клетки са проведени съответно, като се използва комплект за изолиране на РНК в кръвта (RP4001, BioTeke, Пекин, Китай) и реагент Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), съгласно протокола на производителя.

Реактиви

Разтворът на гемцитабин (Eli Lilly, Indianapolis, IN, САЩ) се разрежда в среда за клетъчни култури до 100-μM запас и след това се добавя директно към среда за клетъчна култура, в съответствие с целта на експериментите. Крайните концентрации на разтворителите в среда са 0,1% или по-малко.

Жизнеспособност на клетките

Жизнеспособността се измерва, като се използва анализ на 3- (4,5-диметилтиазол-2-ил) -2,5-дифенилтетразолиев бромид (MTT). MIA-PaCa2 или MIA-PaCa2-GEM клетки се поставят в 96-ямкови плаки в продължение на една нощ преди третиране с гемцитабин или носител. За лечение на siRNA или miR имитиращ/инхибитор, клетките се трансфектират с РНК олигорибонуклеотиди в присъствието или отсъствието на 100 пМ гемцитабин. В края на лечението се добавят 10% v/v от 5 mg/ml разтвор на МТТ агент (Sigma-Aldrich) за 2 h. След това средата беше отстранена и клетките бяха разтворени в DMSO (Sigma-Aldrich). Относителната цитотоксичност се определя чрез измерване на абсорбцията при 570 nm с помощта на луминометър (Molecular Devices, САЩ).

Апоптоза

Клетките се оцветяват с конюгиран с FITC анексин V (BD Biosciences, Хайделберг, Германия) и пропидиев йодид (5 mg/ml) (Sigma-Aldrich) и се анализират чрез Flow Cytometer (Beckton Dickinson, BD Biosciences, Германия), както е описано [16 ].

qRT-PCR

Концентрациите на РНК се измерват с спектрофотометър NanoDrop 2000 (Nano Drop Technologies, Wilmington, USA) и 500 ng обща РНК или miRNA се транскрибират обратно в cDNA, използвайки РНК с голям капацитет в cDNA KIT (Thermo Fisher Scientific GmbH, Dreieich, Германия) или комплектът за обратна транскрипция Taqman microRNA (Thermo Fisher Scientific GmbH, Dreieich, Германия). PCR в реално време се извършва с помощта на основния микс Taqman Gene Expression (Thermo Fisher Scientific GmbH, Dreieich, Германия) или mirVana ™ qRT-PCR miRNA Detection Kit (Ambion, САЩ). Праймери за miRNAs и вътрешен контрол U6 са от Thermo Fisher Scientific GmbH (Dreieich, Германия), а праймери за RRM2 и вътрешен контрол GAPDH са проектирани и синтезирани от Shenggong Company (Шанхай).

Western blot анализ

Цялоклетъчни протеинови екстракти се приготвят с помощта на RIPA лизисен буфер (50 mM Tris, pH 7,4; 150 mM NaCl; 1 mM всеки от NaF, NaVO4 и EGTA; 1% NP40; 0,25% натриев дезоксихолат; 0,2 mM фенилметилсулфонил флуорид; 1 μg/ml всеки антипаин, апротинин и химостатин; 0,1 μg/ml левпептин; 4,0 μg/ml пепстатин) и открити чрез Western blot анализ, както е описано [16]. Използваните антитела са миши моноклонални към RRM2 (ab57653, Abcam, Cambridge, UK), миши моноклонални към каспаза-3 (ab13585, Abcam, Cambridge, UK), миши моноклонални към β-актин (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, САЩ) и конюгирано с HRP вторично антитяло от биотехнологията Santa Cruz (Santa Cruz, CA, USA).

Липотрансфекция

MiR имитиращи или инхибитори или siRNA бяха трансфектирани в клетки с HiPerFEct трансфекционен реагент (Qiagen, Hilden, Германия), съгласно инструкциите на производителя. За Mock трансфекция се използва само реагент за трансфекция.

miR-20a-5p mimic: 5′-UAAAGUGCUUAUAGUGCAGGUAG-3 ′ (MCH01529, abmgood), miRNA Mimic Negative Control (MCH00000, abmgood), miR-20a-5p инхибитор (MIH01529, abmgood MI) ) са закупени от Sigma.

Анализ на репортер с двойна луцифераза

Предполагаемото място за свързване на miR-20a-5p в 3′-UTR на целевия ген RRM2 (wt или mut, Фигура 3А) са клонирани в psi-CHECK (Promega) вектор след луцифераза 3 ′ UTR като първичен луциферазен сигнал с rellina луцифераза като нормализиращ сигнал и обозначен като psiRRM2-wt и psiRRM2-mut. Самият вектор psi-CHECK предоставя сигнал за ренила луцифераза като нормализация, за да компенсира разликите между ефективността на трансфекцията и добива. Трансфекцията в клетки HEK293 се извършва с помощта на Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Дейностите на Renilla и луцифераза на светулка бяха измерени 24 часа след трансфекцията с двойно-луциферазна система за анализ на репортери (Promega, Mannheim, Германия), като се използва луминометър (Molecular Devices, САЩ). Относителната активност на Renilla луцифераза се анализира в съответствие с инструкциите на производителя (Promega, Mannheim, Германия).

Статистическа оценка

Експресия на miRNAs, свързани с RRM2, и miR-20a-5p директно насочват към RRM2 3′-UTR

За да се открият различия в свързаната с RRM2 експресия на miRNAs между MIA-PaCa2 и MIA-PaCa2-GEM клетки, беше извършено профилиране на експресия на miRNA. От всичките осем miRNAs (Фигура 2А), предвидени от TargetscanSites, picTarSites, RNA22Sites, PITASites или miRandaSites.org алгоритми, miR-20a-5p показа най-значимата диференциална експресия (намалена ∼75%, P 0,05) (Фигура 2D). Взети заедно, тези открития показват, че miR-20a-5p драстично намалява в GEM-резистентните ракови клетки на панкреаса и се свързва директно с предсказаната последователност на RRM2 3′-UTR.

Експресията на свързани с RRM2 miRNAs и miR-20a-5p директно насочва към RRM2 3′UTR

miR-20a-5p инхибира протеиновата експресия на RRM2 и обръща резистентността към гемцитабин

Въз основа на горните резултати предположихме, че miR-20a-5p може да блокира резистентността към гемцитабин чрез намеса в експресията на RRM2. Липофекцията на имитиращ или контролен miR-20a-5p се използва в MIA-PaCa2-GEM клетки, което води до силно засилена експресия на miR-20a-5p в резистентни към гемцитабин клетки след 48 часа (Фигура 3А). Едновременно с това, експресията на RRM2 протеин беше значително намалена (Фигура 3В). И накрая, извършихме кинетика на реакция във времето, оценена чрез MTT анализ (Фигура 3С, 0–72 часа) и анализ на апоптоза (Фигура 3D, след 72 часа) в MIA-PaCa2-GEM клетки след липотрансфекция с имитация или контрол на miR-20a-5p в присъствието на гемцитабин. Комбинацията от гемцитабин (100 nM) с фалшив или miR-контрол няма очевиден ефект в MIA-PaCa2-GEM клетки, докато miR-20a-5p имитира силно намалява жизнеспособността на MIAPaCa2-GEM клетки в присъствието на гемцитабин (Фигура 3С ). Междувременно комбинацията от имитиращ miR-20a-5p с гемцитабин значително повишава цитотоксичността в MIA-PaCa2-GEM клетки (Фигура 3D). Но комбинацията от инхибитор на miR-20a-5p с гемцитабин не повлиява жизнеспособността на клетките и цитотоксичността в MIA-PaCa2-GEM клетки (Фигура 3Е и F). По този начин повишеното miR-20a-5p имаше способността да насочва към инхибиране на експресията на MMR2 протеин и обратна резистентност към гемцитабин в нашето проучване.

miR-20a-5p е насочен към RRM2, за да обърне резистентността към гемцитабин

miR-20a-5p служи като предиктор за прогнозиране на ефикасността на GEM-базирана химиотерапия при първа линия на лечение на пациенти с рак на панкреаса

Дискусия и заключение

Понастоящем ракът на панкреаса остава силно злокачествен тумор и прогнозата е изключително лоша. Химиотерапията, базирана на гемцитабин, е в основата на мултимодалната терапия и подобрява прогнозата на пациентите с рак на панкреаса [17], но ефектът от нея е умерен поради високата лекарствена резистентност. Скринингът на тъканни проби за няколко miRNAs разкри убедителни доказателства, че голям брой miRNAs са неправилно регулирани в устойчиви на лекарства ракови клетъчни линии [18]. Изследвахме ролята на miR-20a-5p, една потенциална miRNA насочена към субединицата на активността на рибонуклеотид редуктазата - RRM2, в свързаната с рак на панкреаса резистентност към гемцитабин в настоящото проучване.

Генът за лекарствена резистентност, RRM2, намалява фармакологичната активност на гемцитабин, като влияе върху неговия метаболизъм в раковите клетки на панкреаса [19]. Предишни доказателства сочат, че RRM2 може да предскаже прогнозата на пациенти, лекувани с гемцитабин, тъй като относително високата експресия на този ген при рак на панкреаса е свързана с лоша прогноза, а пациентите, които не се възползват от лечението с гемцитабин, са склонни да имат повишена експресия на RRM2 [20] . В допълнение, регулирането на RRM2 надолу в раковите клетки на панкреаса може да увеличи тяхната хемочувствителност към гемцитабин [21]. Наблюдавахме, че иРНК и протеинът на RRM2 се регулират нагоре в установени устойчиви на гемцитабин ракови клетки на панкреаса, което е в съответствие с предишни проучвания [19,20]. Освен това, намаляването на експресията на RRM2 чрез siRNA възстановява чувствителността на резистентните към гемцитабин клетки към това лекарство. Тези резултати показаха, че RRM2 играе съществена роля за медииране на резистентност към гемцитабин при рак на панкреаса линия MIA-PaCa2, допълнително доказа положителната роля на RRM2 в придобитата резистентност към гемцитабин.

Следователно, оценката на експресията на miR-20a-5p в клинични проби се оказва решаваща при прогнозирането на лекарствената резистентност, тъй като е доказано, че RRM2 води до по-малка полза от лечението с гемцитабин при пациенти с рак на панкреаса, които имат повишена експресия на RRM2 [20 ]. Настоящото проучване разкри значителна връзка между експресията на miR-20a-5p и клиничния отговор на химиотерапия на базата на гемцитабин при пациенти с рак на панкреаса. Пациенти, които са силно изразени miR-20a-5p, са се възползвали от терапията с гемцитабин в сравнение с пациенти с нисък miR-20a-5p. И нивото на експресия на miR-20a-5p може да бъде нов независим предиктор за клиничния отговор на гемцитабин при пациенти с рак на панкреаса. Взети заедно, miR-20a-5p служи като предиктор за ефективността на химиотерапията на базата на гемцитабин при пациенти с рак на панкреаса.

В заключение демонстрираме в настоящото проучване, че RRM2 инхибира противораковия ефект на гемцитабин в раковите клетки на панкреаса и че miR-20a-5p отрицателно регулира този ефект. Отговорът на гемцитабин в Mia-PaCa2-GEM клетки се контролира чрез генетична манипулация на miR-20a-5p и RRM2. В допълнение, клиничните данни разкриват, че пациентите, които силно изразяват miR-20a-5p, се възползват от химиотерапия на базата на гемцитабин по отношение на PFS. Разгледани заедно, резултатите предполагат, че miR-20a-5p медиирана RRM2-свързана резистентност към гемцитабин и miR-20a-5p могат да служат като предиктор за прогнозиране на ефикасността на химиотерапията на базата на гемцитабин при първа линия на лечение на пациенти с рак на панкреаса.

Принос на автора

Weiming Hu и Huimin Lu бяха отговорни за дизайна на проучването. Huimin Lu, Shan Lu и Dujiang Yang бяха отговорни за търсенето на литература. Huimin Lu, Ling Zhang, Jun Ye и Mao Li бяха отговорни за извличането и анализа на данни. Weiming Hu и Huimin Lu бяха отговорни за изготвянето на ръкописа. Всички автори одобриха окончателната версия на ръкописа.

Конкуриращи се интереси

Авторите заявяват, че с ръкописа няма свързани конкурентни интереси.

Финансиране

Авторите заявяват, че няма източници на финансиране, които да бъдат признати.