Отдел по гастроентерология, Катедра по медицина, Медицински център на университета Дюк, Дърам, NC 27710, Съединени американски щати, Отдел по гастроентерология, Болница Санта Мария, CHLN, Лисабон, Португалия

миши

Отделение по гастроентерология, Катедра по медицина, Медицински център на университета Дюк, Дърам, NC 27710, Съединени американски щати

Отделение по гастроентерология, Катедра по медицина, Медицински център на университета Дюк, Дърам, NC 27710, Съединени американски щати

Отделение по гастроентерология, Катедра по медицина, Медицински център на университета Дюк, Дърам, NC 27710, Съединени американски щати

Отделение по гастроентерология, Катедра по медицина, Медицински център на университета Дюк, Дърам, NC 27710, Съединени американски щати

Отдел по ендокринология, Университетски медицински център на Дюк, Дърам, NC 27710, Съединени американски щати

Партньорски отдел по патология, Медицински център на университета Дюк, Дърам, NC 27710, Съединени американски щати

Отделение по гастроентерология, Катедра по медицина, Медицински център на университета Дюк, Дърам, NC 27710, Съединени американски щати

  • Мариана Верделхо Мачадо,
  • Григорий Александър Микелоти,
  • Гуанхуа Сие,
  • Тиаго Перейра де Алмейда,
  • Джером Бурсие,
  • Бретан Бохник,
  • Синтия Д. Гай,
  • Ана Мей Дил

Корекция

29 юни 2015 г .: Machado MV, Michelotti GA, Xie G, de Almeida TP, Boursier J, et al. (2015) Корекция: Моделите на мишките на индуциран от диета неалкохолен стеатохепатит възпроизвеждат хетерогенността на човешката болест. PLOS ONE 10 (6): e0132315. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0132315 Преглед на корекцията

Фигури

Резюме

Предистория и цели

Безалкохолният стеатохепатит (NASH), потенциално прогресиращата форма на безалкохолна мастна чернодробна болест (NAFLD), е пандемичното чернодробно заболяване на нашето време. Въпреки че има няколко животински модела на NASH, липсва консенсус относно оптималния модел. Направихме за цел да сравним характеристиките на NASH в двата най-широко използвани модела на мишки: диета с дефицит на метионин-холин (MCD) и западна диета.

Методи

Мишките са хранени със стандартна чау, MCD диета за 8 седмици или западна диета (45% енергия от мазнини, предимно наситени мазнини, с 0,2% холестерол, плюс питейна вода, допълнена с фруктоза и глюкоза) в продължение на 16 седмици. Сравнени са чернодробна патология и метаболитен профил.

Резултати

Метаболитният профил, свързан с човешкия NASH, се имитира по-добре от западната диета. Въпреки че чернодробната стеатоза (т.е. натрупването на триглицериди) също е по-тежка, съдържанието на неестерифицирани мастни киселини в черния дроб е по-ниско, отколкото в групата с диета с MCD. NASH е също така по-малко тежък и по-малко възпроизводим в модела на Западна диета, както се вижда от по-малко смърт/апоптоза на чернодробните клетки, възпаление, дуктуларна реакция и фиброза. Различни механизми, замесени в човешката патогенеза/прогресия на NASH, също са по-малко стабилни в модела на Западна диета, включително оксидативен стрес, ER стрес, дерегулация на автофагия и активиране на пътя на таралежите.

Заключение

Храненето на мишки със западна диета моделира метаболитни смущения, които са често срещани при хора с лека NASH, докато прилагането на MCD диета по-добре моделира патобиологичните механизми, които карат човешкия NAFLD да напредва към напреднал NASH.

Цитат: Machado MV, Michelotti GA, Xie G, de Almeida TP, Boursier J, Bohnic B, et al. (2015) Модели на мишки на безалкохолен стеатохепатит, предизвикан от диета, възпроизвеждат хетерогенността на човешката болест. PLoS ONE 10 (5): e0127991. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0127991

Академичен редактор: Silvia C. Sookoian, Институт за медицински изследвания A Lanari-IDIM, Университет в Буенос Айрес-Национален съвет за научни и технологични изследвания (CONICET), ARGENTINA

Получено: 13 март 2015 г .; Прието: 22 април 2015 г .; Публикувано: 27 май 2015 г.

Наличност на данни: Всички релевантни данни се намират в хартията и нейните поддържащи информационни файлове.

Финансиране: Това изследване се подкрепя от NIH DK0077794 и DK053792 (Diehl AM) и Duke Endowment: The Florence McAlister Professorship (Diehl AM). MVM получи докторска стипендия от Fundação para a Ciência e Tecnologia, FCT, Португалия. Финансистите не са играли роля в дизайна на проучванията, събирането и анализа на dara, решението за публикуване или подготовката на ръкописа.

Конкуриращи се интереси: Авторите са декларирали, че не съществуват конкуриращи се интереси.

Въведение

Безалкохолната мастна чернодробна болест (NAFLD) е най-разпространеното чернодробно заболяване в западното общество [1]. Смята се, че един милиард субекти имат NAFLD по целия свят [2]. Въпреки че по-голямата част от пациентите ще имат доброкачествена еволюция, до 25% развиват потенциално прогресиращо увреждане на черния дроб, наречено неалкохолен стеатохепатит (NASH). NASH се характеризира с увреждане/смърт на чернодробни клетки, възпаление и повишен риск от чернодробна фиброза и канцерогенеза [3]. NAFLD/NASH е третата водеща индикация за чернодробна трансплантация в САЩ и втората причина за трансплантация на черен дроб на хепатоцелуларен карцином [4].

Въпреки че много е научено за NAFLD от първите му описания преди тридесет години, все още има огромни пропуски в знанията относно неговата патогенеза, прогноза, профилактика и лечение. Изучаването на NAFLD при хора е затруднено от факта, че той обхваща спектър от условия, трудни за диференциране неинвазивно. Също така, NAFLD е много бавно прогресиращо заболяване, което пречи на проспективните наблюдателни изследвания. Предвид тези предизвикателства животинските модели, които имитират човешка патология, са необходимост. Перфектният животински модел ще развие NAFLD в контекста на ключови рискови фактори за човешкото състояние (т.е. затлъстяване и метаболитен синдром, МС), в крайна сметка ще прояви всички хистологични характеристики на NASH, прогресира до напреднала чернодробна фиброза и ще бъде податлив на хепатоцелуларен карцином . Важното е, че идеалният модел на NASH трябва да изисква малко време и разходи за разработване/поддържане и да бъде силно възпроизводим. Има няколко индуцирани от диетата модели на NAFLD/NASH при малки животни. Обикновено се предпочитат мишките поради късата им продължителност на живота и лекотата на генетично манипулиране на предполагаемите патогенни/защитни пътища.

Най-широко използваната диета за индуциране на NAFLD/NASH е диетата с дефицит на метионин-холин (MCD). Стандартната MCD диета също има високо съдържание на захароза (40% от енергията) и е умерено обогатена с мазнини (10–20%). Това е много възпроизводим модел, който последователно индуцира фенотип на тежък NASH след 8 седмици на приложение [5]. MCD диетата обаче е критикувана, тъй като причинява загуба на тегло и не предизвиква особености на МС, важен рисков фактор за NAFLD [6]. Диетата с високо съдържание на мазнини е друг силно проучен подход за развитие на NAFLD. Хетерогенността на такива диети затруднява сравняването на изследвания от различни изследователски групи. Въпреки това, стандартните диети с високо съдържание на мазнини обикновено не предизвикват значителни NASH (т.е. смърт на чернодробни клетки, възпаление или фиброза), дори когато се хранят повече от 28 седмици, въпреки че възпроизводимо затлъстяване, МС и чернодробна стеатоза [7]. Съвсем наскоро се използва модифицирана диета с високо съдържание на мазнини за моделиране на NAFLD/NASH. Тази диета е обогатена с наситени мастни киселини и допълнена с холестерол, както и еквиваленти на царевичен сироп с високо съдържание на фруктоза, имитирайки стила на бързото хранене, характеризиращ „западната диета“ [8]. Западната диета има предимството да предизвиква затлъстяване и МС при мишки, въпреки че изисква продължително приложение.

В това проучване направихме сравнение на главата до главата на MCD и западната диета, след като контролирахме множество променливи, които влияят върху метаболизма и патогенезата на NAFLD: генетичен произход на мишката, възраст, пол и разлики в светлината, свързани с животински съоръжения тъмно колоездене и местна микробна флора. Резултатите идентифицират важни разлики, предизвикани от диетата, които могат да обяснят защо двете диети моделират различни етапи на патогенезата на NAFLD.

Методи

Изследвания върху животни

Мъжки мишки от див тип (WT) C57Bl/6 са получени от лабораторията на Джаксън и са хранени с диета с чау (диета Picolab за гризачи 20, # 5053; n = 13 мишки); MCD диета (MP Biomedicals, # 960439; n = 15 мишки) за 8 седмици, или западна диета (TD.120330 22% HVO + 0,2% холестерол диета, Teklad Research, допълнена с еквиваленти на фруктозен сироп с висока царевица в питейната вода, което е 42 g/L глюкоза и фруктоза, съответно 55% и 45%, w/w; n = 8 мишки) за 16 седмици. Характеристиките на диетите са обобщени в таблици S1 и S2. Интервенциите започват на 12-седмична възраст за MCD диета и 4 седмици за западна диета, за да се завърши протоколът на 20-седмична възраст при всички мишки. Грижите за животните и процедурите са одобрени от института за грижа за животните на университета Дюк и са изпълнили изискванията на Националния здравен институт и университета Дюк IACUC за хуманна грижа за животните.

Човешки проби

Чернодробни биопсии от донори на чернодробна трансплантация (n = 5) и възрастни пациенти с NASH с лека фиброза (F0-1) (n = 5) или тежка фиброза (F3-4) (n = 5) са избрани на случаен принцип от здравната система на Университета Дюк NAFLD Клинична база данни и биохранилище. Пациентите са дали информирано съгласие по време на набирането. Преди този анализ записите на пациентите бяха анонимизирани и премахнати. Проучванията бяха одобрени от Duke IRB и проведени в съответствие с Националните здравни институти и институционалните насоки за изследване на човешки субекти.

Хистопатологичен анализ

Фиксираните с формалин парафинови чернодробни секции бяха оцветени с H&E и оценени за тежест на NAFLD от обучен патолог, съгласно критерии, описани от Brunt et al. [9]. Имунохистохимията е направена, както е описано по-горе, с антителата, посочени в таблица S3 [10]. Чернодробната фиброза се оценява чрез оцветяване с Picrosirius red (# 365548, Sigma) [10]. Оцветяването с TUNEL (11684817910, Roche) е извършено в съответствие с предложенията на производителя.

Анализ на серума и тъканите

Чернодробните ензими бяха изследвани от Ветеринарната диагностична лаборатория, Отдел за лабораторни животински ресурси, Медицински център на университета Дюк. Инсулинът се измерва с ултрачувствителен миши инсулин ELISA комплект (Crystal Chem Inc: # 90080); липидите се измерват в серума и черния дроб с комплект за колориметричен анализ на триглицериди (Cayman Chemical Company: # 10010303), комплект за количествено определяне на свободни мастни киселини (Abcam, ab65341) и набор за количествено определяне на холестерола (Abcam, ab65359); серумният лептин и адипонектин бяха определени с помощта на комплекти за мишка Abcam за ELISA, ab100718 и ab108785, съответно. Съдържанието на хидроксипролин в черния дроб е количествено определено, както е описано по-горе [11].

Молекулярни изследвания

количествено определяне на иРНК чрез обратна транскрипция-PCR в реално време (RT-PCR).

Общата РНК беше извлечена от черния дроб, използвайки TRIzol (Invitrogen). РНК се транскрибира обратно в шаблони на cDNA, като се използва произволен праймер и Super Script RNAse H-обратна транскриптаза (Invitrogen) и се усилва. Полуколичествената qRT-PCR беше извършена с помощта на iQ-SYBR Green Supermix (Bio-Rad) и StepOne Plus PCR платформа в реално време (ABI/Life Technologies), както беше описано по-рано [12]. За грундове вижте таблица S4.

Западно петно.

Общи протеини бяха извлечени от целия черен дроб, използвайки RIPA буфер (Sigma). Протеините се разделят чрез електрофореза върху 4% -20% Criterion гелове (BioRad), транслотират се в мембрани от поливинилиден-дифлуорид и се инкубират с първични антитела, изброени в таблица S5.

Статистика

Резултатите бяха изразени като средна стойност ± SEM. Значимостта е установена с помощта на тестове на Kruskal-Wallis и Mann-Whitney, със значимост p Фиг. 1. Ефекти от диетата с MCD и западната диета върху метаболитния профил.

WT мишките са хранени с диу чау, MCD диета за 8 седмици или западна диета за 16 седмици и са жертвани на 20 седмична възраст. (А). Тежести на тялото; (Б). Адипокини (лептин и адипонектин); (° С). Серумна глюкоза на гладно и HOMA-IR индекс; (Д). Серумни триглицериди и неестерифицирани мастни киселини (NEFA’s). Графират се средните ± SEM резултати. * Фиг. 2. Ефекти от MCD диетата и западната диета върху чернодробната стеатоза и чернодробните ензими.

(А). Съотношение на черния дроб към телесното тегло (LBW), серумни аминотрансферази (ALT, AST) и алкална фосфатаза (ALP) от мишки, хранени с чау, MCD или западни диети. (Б). H&E оцветяване на представителни чернодробни секции от мишки (леви панели) и пациенти с NASH с лека или тежка фиброза (десни панели). (° С). Маслено червено O оцветяване на представителни чернодробни секции от мишки (леви панели) и нива на чернодробните липиди (вдясно). (Д). qRT-PCR анализ на чернодробни гени, кодиращи липидни метаболитни ензими. Резултатите се нормализират на мишки, хранени с чау-диета и се графицират като средно ± SEM. * Фиг. 3. Ефекти от MCD диетата и западната диета върху фиброзата на черния дроб и дуктуларната реакция.

(А). Съдържание на чернодробен хидроксил-пролин и qRT-PCR анализ на чернодробна фиброза и прогениторни маркери гени; (Б). Чернодробни секции от представителни мишки, оцветени за маркери на фибродуктуларната реакция (Sirius red, α-SMA, desmin, K19 и Sox-9) (леви панели) и съответна морфометрия (вдясно). Резултатите се нормализират при хранени с чау мишки и се графицират като средно ± SEM. * Фиг. 4. Ефекти от MCD диетата и западната диета върху смъртта на чернодробните клетки, възпалението и оксидативния стрес.