Резюме

Отдавна ниацинът се счита за високоефективно лекарство за благоприятно лечение на липидни аномалии, но неговите анти-атеросклеротични ефекти са оспорени от последните проучвания. Тук демонстрирахме, че пероралното добавяне на ниацин води до значително намаляване на телесното тегло и мастната маса, без това да повлияе на приема на храна при диети от мишки с високо съдържание на мазнини, но не и при мишки с дефицит на GPR109A. По-нататъшно разследване показа, че предизвикването на ниацин води до забележително инхибиране на чернодробната липогенеза чрез GPR109A-зависим път ERK1/2/AMPK. Освен това демонстрирахме, че лечението с ниацин стимулира термогенезата в кафява мастна тъкан чрез индукция на термогенни гени чрез GPR109A. Освен това наблюдаваме, че мишките, изложени на ниацин, показват драстично намаляване на чревната абсорбция на мастни киселини. Заедно нашите данни показват, че въздействайки на GPR109A, ниацинът показва потенциала да поддържа енергийна хомеостаза чрез фина настройка на чернодробната липогенеза, BAT/бежовата термогенеза и абсорбцията на чревни мазнини, представлявайки потенциален подход за лечение на липидни аномалии.

енергийната

Въведение

Честотата на наднорменото тегло и затлъстяването се е превърнала в глобална епидемия с над 1,9 милиарда наднормено тегло и 600 милиона затлъстели индивиди по целия свят (Ng et al, 2014; Wang et al, 2011). Затлъстяването се причинява от необичайно излишно съхранение на енергия като липиди в мастната тъкан поради нетен дисбаланс между енергийния прием и енергийните разходи (Lowell & Spiegelman, 2000; Olsen et al, 2017). Затлъстяването се счита за основен рисков фактор за множество съпътстващи заболявания, включително основни заболявания като сърдечно-съдови заболявания, диабет и рак (Haslam & James, 2005; Kopelman, 2000). Въпреки неотдавнашните огромни усилия, ефективните фармакотерапии срещу затлъстяването все още са ограничени. Освен това към днешна дата настоящите средства за затлъстяване са предназначени да намалят приема на храна и апетита чрез молекулярни пътища, базирани на хипоталамуса, но за съжаление тези агенти проявяват тежки психиатрични или сърдечно-съдови странични ефекти (Cunningham & Wiviott, 2014; Manning et al, 2014; Морейра и др., 2009). Следователно, мащабът на настоящата здравна епидемия засилва необходимостта от алтернативни терапевтични стратегии, целящи да контролират телесното тегло чрез потенциални цели в периферните невронални тъкани.

След откриването на намаляващи нива на плазмения холестерол през 1955 г. никотиновата киселина (ниацин) се използва за лечение на дислипидемия като одобрено лекарство повече от половин век (Altschul et al, 1955; Carlson, 2005). Редица рандомизирани клинични проучвания показват, че монотерапията с ниацин е показала, че значително увеличава нивата на HDL-C и намалява нивата на триглицеридите (Elam et al, 2000; Guyton et al, 1998). Точният му механизъм обаче не беше добре разбран, докато през 2003 г. сираковият рецептор GPR109A (наскоро преименуван на рецептор 2 на хидроксилкарбонова киселина или HCA2) не беше идентифициран като рецептор с висок афинитет към ниацин, независимо от три изследователски групи (Offermanns et al, 2011; Soga et al, 2003; Tunaru et al, 2003; Wise et al, 2003). Впоследствие бета-хидрокси бутиратът на кетонното тяло беше идентифициран като ендогенен лиганд за GPR109A (Taggart et al, 2005). В адипоцитите, при стимулиране от ниацин, GPR109A функционира чрез Gi/o протеини за намаляване на вътреклетъчното производство на сАМР, което води до намалено активирано от протеин киназа А активиране на хормон-чувствителна липаза (HSL), което от своя страна намалява хидролизата на триглицеридите до свободни мастни киселини ( FFA) (Digby et al, 2009). Тази хипотеза за FFA се подкрепя от доказателства, че ниацин не е успял да понижи FFA и TG при мишки с GPR109A-нокаут (Tunaru et al, 2003).

Установените клинични ползи от лечението с ниацин върху сърдечно-съдови събития са оспорени от неотдавнашни проучвания, които показват, че ниацинът оказва своите благоприятни ефекти върху GPR109A-медиираната анти-атеросклеротична активност независимо от неговите анти-липолитични свойства (Lukasova et al, 2011a; Wu et al, 2010 ). Тези данни обаче не изключват възможността ниацинът да осигурява сърдечно-съдови ползи по независим от липолизата начин чрез GPR109A. Доказано е, че медиираният от ниацин полезен сърдечно-съдов ефект е преносим с GPR109A-компетентни клетки на костния мозък (Wu et al, 2010). В допълнение, натрупващите се доказателства показват, че активирането на GPR109A е в състояние да предизвика противовъзпалителни ефекти не само върху атеросклерозата, но също така и при остър исхемичен инсулт, артрит, хронична бъбречна недостатъчност и сепсис чрез инхибиране на хемотаксиса на имунните клетки и производството на противовъзпалителни цитокини ( Chen et al, 2014;

Cho et al, 2009; Digby et al, 2012; Kwon et al, 2011; Лукасова и др., 2011а; Митрофанов и др., 2005; Rahman et al, 2014; Shehadah et al, 2010; Shi et al, 2017; Wu et al, 2010). Следователно са необходими повече проучвания за цялостна оценка на GPR109A-медиираните плейотропни ефекти върху атерогенезата и други метаболитни заболявания.

GPR109A-индуцирано инхибиране на липолизата на адипоцитите и мобилизирането на мастни киселини в отговор на продължително лечение с ниацин би довело до прекомерен синтез на TG и затлъстяване (Ganji et al, 2004). По време на процеса на размножаване на GPR109A-нокаут мишки, които въведохме от лабораторията на д-р Offermanns, установихме, че нокаут мишките GPR109A са по-склонни към затлъстяване в сравнение с мишки от див тип. Следователно ние инициирахме това проучване, за да изследваме ролята на ниацин/GPR109A в регулирането на липидния метаболизъм, използвайки мишки с нокаут с GPR109A, комбинирани с модел на мишка със затлъстяване, индуциран с високо съдържание на мазнини (HFD). Ние показваме, че при активиране от ниацин, GPR109A прецизира липидния метаболизъм чрез многопътни пътища, включително инхибиране на хепатоцитната липогенеза и абсорбция на мастни киселини и насърчаване на термогенезата на кафява мастна тъкан (BAT).

Резултати

GPR109A Дефицитни животни показват затлъстяване

A, B телесното тегло (A) и приема на храна (B) се записват ежеседмично (n = 16-17). C бяха показани представителни изображения на мастна маса. D Представителни SEM изображения в черния дроб (леви панели; скални ленти, както е показано на фигурата) и мускулите i (средни панели; скални скали, както е показано на фигурата), и H -/- мишки и мишки, предизвикани с CHBA, специфична малка молекула агонист за GPR81 (Фигури 2F и EV2A). Също така направихме тест за толерантност към глюкоза (GTT) и тест за толерантност към инсулин (ITT) и документирахме, че мишките, третирани с ниацин, са по-малко толерантни към глюкоза, но показват инсулинолерант, сравним с контролните мишки (Фигура 2G) Не са открити промени по GTT и ITT при третирани с ниацин мишки Gpr109a -/- и мишки от див тип, предизвикани от CHBA (Фигура EV2B). Количественият анализ показа, че лечението с ниацин води до значително намаляване на инсулина в кръвта (Фигура 2Н), но предизвикателството на HFD-хранени мишки с ниацин показва значително намаляване на стойностите на HOMA-IR в сравнение с третирани с носител мишки (Фигура 2I), което предполага благотворната роля на ниацин в инсулиновата чувствителност.

Липсата на GPR109A предотвратява действията на ниацин срещу затлъстяване

За да потвърдим по-нататък ролята на GPR109A в действието на ниацин срещу затлъстяването, предизвикахме с ниацин мъжки мишки, хранени с HFD, Gpr109a -/-. Както е посочено на фигура 3, Предизвикателството на HfD-хранени мишки Gpr109a -/- с ниацин показва подобно увеличаване на теглото, тегло на мастната тъкан, тегло на органи и прием на храна по отношение на третирани с носител Gpr109a -/- мишки (Фигура 3A-C, и Д). Хистологичното наблюдение също не показва разлика в натрупването на липиди между третирани с ниацин и третирани с носител Gpr109a -/- мишки (Фигура 3D). Тези резултати предполагат, че ниацин упражнява своите регулаторни ефекти върху липидния метаболизъм чрез GPR109A.

A, B телесното тегло (A) и приема на храна (B) се записват ежеседмично (n = 10-11). C бяха показани представителни изображения на мастна маса. D Представителни SEM изображения в черния дроб (леви панели; скални ленти, както е показано на фигурата) и мускулите (средни панели; скални скали, както е показано на фигурата) и H&E оцветяване на епидидимална бяла мастна тъкан (eWAT) (десни панели; скални скали, 100 μm). E Теглото на мастната подложка и органите се записва след анестезия на мишки (n = 10-11). Информация за данните: Всички данни са представени като средства ± SEM. В (A, B, E) данните са анализирани чрез не-сдвоен двустранен t-тест на ученик. ns, без значение.

Ниацин директно инхибира липогенезата на хепатоцитите чрез GPR109A

Нашите данни ясно показват, че при активиране от ниацин, GPR109A упражнява своите инхибиращи ефекти върху натрупването на липиди в мастната тъкан, черния дроб и мускулите, когато се храни с HFD. Освен това, оцветяването с маслено червено и количественият анализ разкриват, че мишките, хранени с HFD, показват значително увеличение на съдържанието на чернодробни триглицериди, докато добавката с ниацин води до значително намаляване на съдържанието на триглицериди в черния дроб (Фигура 4А и В), за разлика от това, няма разлика в Наблюдавани са нива на TC и FFA (фиг. 4В). В допълнение, намаляването на нивото на чернодробния инсулин се наблюдава при мишки с предизвикателство за ниацин (Фиг. 4С), съвпадащо с резултата в серума. Въпреки това, животните остават непроменени в приема на храна. След това изследваме дали ниацинът играе роля в регулирането на липогенезата чрез GPR109A. За първи път използвахме qRT-PCR за количествен анализ на експресията на GPR109A в миши черен дроб.

AMPK и ERK1/2 участват в GPR109A-медиирано инхибиране на хепатоцитната липогенеза

В допълнение, ние също така оценихме ролята на ниацин/GPR109A сигнализиране в преадипоцитната диференциация. Ниацинът показва стимулиращ ефект върху индуцирането на диференциация на клетките предшественици на кафява мазнина с максимална активност при 250 μM (Фигура 6F). Допълнителен RT-PCR анализ в реално време разкри, че лечението с ниацин значително регулира нивата на транскриптите на UCP1, PGC-1a и PRDM16 (Фигура 6G).

Ниациновата стимулация намалява абсорбцията на мастни киселини чрез GPR109A

A Фекалната маса се нормализира до телесно тегло (mg/g). Фекалните липиди бяха извлечени и концентрацията на фекалните липиди беше изразена като милиграм липиди на грам тегло на изпражненията. Общ триглицерид, общ холестерол и свободна мастна киселина (FFA) бяха измерени при WT мишки (n = 7,9). Б. Липидните показатели на изпражненията са измерени при мишки Gpr109a -/- (n = 6). ° С Обща тРНК, изолирана от червата и изследвана експресията на иРНК на посочени гени, участващи в абсорбцията на мастни киселини (транспортен протеин на мастна киселина 4 (FATP4) и свързващ протеин от мастна киселина от тип чревен тип (I-FABP)) и абсорбция на холестерол (Niemann-Pick C1 -Подобно на 1 (NPC1L1)) чрез qRT-PCR. Информация за данните: Всички данни са представени като средства ± SEM. В (F, G) Всички данни за показаните клетки са представителни за поне три независими експеримента. Данните бяха анализирани чрез несдвоен двустранен t-тест на студент. * P -ΔΔ CT метод. Циклите на qRT-PCR бяха както следва: Етап 1, препаративна денатурация (30 s при 95 ° С); Стъпка 2, 40 цикъла на денатурация (5 s при 95 ° C) и отгряване (30 s при 60 ° C); Стъпка 3, дисоциация по протокола на производителя. PCR праймерите, използвани в PCR анализа в реално време, са изброени в Таблица S1.

Полуколичествена PCR

Общата РНК се екстрахира с помощта на RNAiso реактивен комплект. CDNA се синтезират с помощта на реактивен комплект PrimeScript RT. PCR се извършва в 20 μL реакционна смес, съгласно инструкциите на KOD-Plus (TOYOBO, Япония). Праймерите, използвани за GPR109A, са посочени в таблица 1. PCR се извършва, като се използва първоначална денатурация при 94 ° C за 5 минути, последвано от 28 цикъла при 94 ° C за 30 секунди, 53 ° C за 30 секунди и 68 ° C за 30 секунди. След 28 цикъла беше извършен допълнителен етап на удължаване при 68 ° С в продължение на 10 минути. Амплифицираните PCR продукти се използват на 1,2% агарозни гелове, съдържащи етидиев бромид.

Хистологичен анализ

За да се изследва чернодробната стеатоза, чернодробни проби бяха вградени в Tissue-Tek (SA-KURA, САЩ), замразени и разделени (10 μm) и съхранявани при -80 ° C до употреба. Срезите бяха оцветени с хематоксилин и маслено червено О (Sigma Aldrich, САЩ) за отлагане на липиди.

За хистология мастните тъкани се фиксират в 10% неутрално буфериран формалин, последвано от дехидратация със степенуван етанол (80-100%) и вграждане в парафин. След това тъканите бяха нарязани на 6 μm парчета с помощта на микротом, депарафинизиран в ксилол, преминал през 80-100% етанол. И оцветяването с хематоксилин и еозин (H&E) се извършва при използване на стандартните техники.

За анализ на трансмисионната електронна микроскопия (ТЕМ) чернодробните и мускулните тъкани се нарязват на 1 mm3 фрагменти и се фиксират чрез потапяне в 2,5% глутаралдехид във фосфатен буфер (0,1 М, рН 7,4) за една нощ при 4 ° С. След това те се промиват в 0,1 М фосфатен буфер за три пъти. След това те бяха фиксирани с 1% осмиев тетроксид (OsO4) в 0,1 М фосфатен буфер за 2 часа при стайна температура. Впоследствие те бяха изплакнати с 0,1 М фосфатен буфер отново три пъти. Тъканите се дехидратират чрез градуирани алкохоли (30, 50, 70, 80, 90, 95 и 100%) за 30 минути. Последно те бяха вградени в Epon 812. Ултратънки секции (с дебелина 70-90 nm) от вградени в Epon проби бяха поставени върху медни решетки и оцветени с уранил ацетат и оловен цитрат. Разрезите бяха изследвани с електронен микроскоп Hitachi модел H-7650 (Hitachi, Япония).

Измерване на активността на ензимите

За да се определят дейностите на ензимите, участващи в липогенезата в черния дроб и бялата мастна тъкан, ензимната фракция източник се приготвя, както следва. Накратко, 10% (w/v) хомогенат се приготвя във фосфатен буферен разтвор (рН 7.2-7.4) и след това се центрофугира при 2000-3000 rpm в продължение на 20 минути и супернатантата се прехвърля в нова епруветка. Пробите се съхраняват при -80 ° C до употреба. Всички ензими, като пируват дехидрогеназа (PDH), ацетил КоА карбоксилаза (ACC), ацетил КоА карбоксилаза 1 (ACC1) и диацилглицерол ацилтрансфераза 2 (DGAT2), са измерени чрез ELISA (Джин Ма, Китай).

Измерване на вътреклетъчен калций

Флуоресцентният индикатор Ca 2+ fura-2 е използван за проследяване на промените в калция. HepG2 клетки се събират с не-ензимен разтвор за клетъчна дисоциация (M&C Gene Technology, Китай), промиват се два пъти с разтвор на Hanks и се суспендират при плътност 5 × 10 6 клетки/ml в балансиран солев разтвор на Hanks, съдържащ 0,025% говежди серумен албумин . След това клетките бяха заредени с 3 μM Fura-2-AM (Dojindo Laboratories) в продължение на 30 минути при 37 ° С. Клетките се промиват два пъти в разтвор на Ханкс и след това се суспендират отново в разтвор на Ханкс при концентрация 1 х 107 клетки/мл. Клетките бяха стимулирани с посочените концентрации на ниацин и потокът Ca 2+ беше измерен, използвайки дължини на вълната на възбуждане от 340 и 380 nm във флуоресцентен спектрометър.

Western blot анализ

Статистически анализ и обработка на данни

За изследвания върху животни n стойностите показват броя на животните в кохорта. За проучвания върху животни размерът на пробите се основава на предишни проучвания и опит. Всички данни за показаните клетки са представителни за поне три независими експеримента. Всички резултати са изразени като средна стойност ± SEM. За статистически анализи е използван софтуерът GraphPad Prism 6 (Сан Диего, Калифорния). Несдвоеният двустранен t-тест на Student беше използван за сравнения между две групи за всички фигури. Разликите се считат за значими, когато P ↵