Резюме

Въведение

Резултатите от епидемиологични проучвания показват, че високата консумация на плодове и зеленчуци е свързана със здравословен начин на живот и ниска честота на рак (1). Вероятно няколко механизма са включени в полезните ефекти на плодовете и зеленчуците, включително витамини, фибри и няколко други биоактивни съединения с по-малко добре характеризирани ефекти. В допълнение, зеленчуците и плодовете имат високо съдържание на антиоксиданти, които са способни да изчистят ROS4 (2) и вероятно също така инхибират тяхното образуване (2, 3) .

плодове

Теоретично ДНК лезиите се превръщат в мутации in vivo, ако не бъдат отстранени от генома чрез системата за възстановяване на ДНК. В клетките на бозайници увреждането на ДНК може да бъде изрязано от два различни вида системи за възстановяване на ексцизия на ДНК, а именно възстановяване на ексцизия на база и ексцизия на нуклеотиди. ERCC1 играе съществена роля в процеса на възстановяване на нуклеотидната ексцизия като част от 5'-разрезния комплекс (9). Основният ензим за възстановяване на ексцизията, OGG1, премахва главно окисления гуанин от ДНК (10). Доколкото ни е известно, експресиите на гените ERCC1 и OGG1 не са изследвани по-рано във връзка с приема на плодове и зеленчуци.

Целта на това изследване беше да се сравни нивото на окислително увреждане на ДНК и възстановителна активност в левкоцитите между индивиди, изчерпани от плодове, зеленчуци и антиоксиданти и лица, допълнени с 600 g плодове и зеленчуци на ден или добавка със съответно съдържание на витамини и минерали.

Материали и методи

Учебен дизайн и предмети.

Изследването е създадено като паралелен дизайн, като участниците са рандомизирани в три групи: консумират ежедневно 600 g плодове и зеленчуци; витаминни таблетки със същото количество антиоксиданти и минерали; или без антиоксиданти (плацебо таблетка) в продължение на 24 дни. Изследването е одобрено от Научния комитет по етика на общините Копенхаген и Фредериксберг (01-234/99).

Априорната хипотеза беше, че ще се наблюдава повишено окислително увреждане на ДНК в групата на плацебо поради оттеглянето на диетичните антиоксиданти, докато окислителното увреждане на ДНК във витаминната група и в групата на плодовете и зеленчуците ще остане непроменено или намалено поради по-висок прием през ученето. Експресията на гени за възстановяване на ДНК е изследвана без никаква априорна хипотеза, тъй като това не е било тествано преди в проучвания за диетична интервенция. Преди проучването изчислихме, че размерът на групата трябва да бъде 15 субекта, за да се наблюдава 50% увеличение на ефекта в групата на плацебо при α = 5% и β = 20% и като се приеме 50% коефициент на вариация, както е наблюдавано по-рано за анализа на кометата и екскреция на 8-oxodG с урината (11, 12, 13, 14). Смятахме, че е разумно да се очаква 50% разлика, тъй като няколко от проучванията, показващи защитни ефекти на антиоксидантите, съобщават за по-големи ефекти в нивото на окислително увреждане на ДНК или чувствителност към H2O2 след намеса с естествени хранителни продукти или мултивитаминни таблетки (15, 16, 17, 18, 19, 20) .

Здрави мъже и жени с нормално тегло бяха наети за проучване чрез реклама в университети и други институции, както и в местния вестник. Критериите за изключване бяха тютюнопушене, затлъстяване, фамилна анамнеза за хронични заболявания, хипертония, употреба на лекарства и тежки физически упражнения. Четиридесет и осем субекта бяха назначени в проучването, след като бяха дали информирано съгласие. Общо 43 субекта са завършили проучването (22 мъже и 21 жени на възраст 21–56 години). Един субект отпадна, защото не можеше да присъства на обяд в рамките на определен интервал от време, а 4 субекта отпаднаха поради събития, несвързани с проучването. Базовите характеристики на субектите, завършили проучването, са дадени в Таблица 1 ⇓ .

Характеристики на субекта и плазмена концентрация на витамин С и каротеноиди в трите групи на изходно ниво (средно и SD) a

Преди началото на контролираната диета, пациентите водеха пълна претеглена диета в продължение на 4 дни и попълниха валидиран въпросник за честотата на храната (21). Според тези данни обичайният прием на плодове и зеленчуци е ~ 280 g/ден. Субектите бяха разпределени на фиксирани индивидуални енергийни приема на базата на телесното тегло, възрастта и нивото на физическа активност (СЗО). По време на проучването телесното тегло се измерва на всеки втори ден и ако теглото варира> 1 кг, субектите се разпределят на различно енергийно ниво или се информират да консумират допълнителна енергия (предоставени като енергийни ролки с идентичен състав на макроелементи като общата диета) . Средният енергиен прием по време на проучването е 13 MJ (диапазон, 9-17 MJ).

Състав на експерименталната диета (грамове прясно тегло/ден) при енергиен прием 10 MJ/ден

Кръвни проби на гладно за анализ на оксидативно увреждане на ДНК и експресии на иРНК са взети преди (ден -1), на 9, 16 и 24 дни по време на интервенцията и 4 седмици (ден 52) след края на интервенцията, когато участниците са имали възобновиха обичайните си диети. Двадесет и четири часа проби от урина бяха събрани преди, четири пъти по време на периода на интервенция и при проследяване 4 седмици след края на интервенцията.

Откриване на окислително увреждане на ДНК в едноядрени кръвни клетки и урина.

24-часовата екскреция на 8-oxodG с урината се определя чрез високоефективна течна хроматография-електрохимична детекция, както е описано по-горе, и изразена като nmol/24 h (5) .

Количество на OGG1 и ERCC1 Експресия на иРНК в левкоцити.

Общата РНК се пречиства от 1,5 ml EDTA стабилизирана пълна кръв, като се използва комплект за изолация на РНК на Qiagen и експресията на OGG1 и ERCC1 иРНК, нормализирана до 18S РНК, се определя чрез обратна транскрипция в реално време-PCR, както е описано другаде (22). Сондите и праймерите за OGG1 бяха: преден грунд, 714F, 5′-AAATTCCAAGGTGTGCGACTG-3 ′; обратен грунд, 796R, 5′-GCGATGTTGTTGTTGGAGGA-3 ′; и сонда, 5′-FAM-CAAGACCCCATCGAATGCCTTTTCTCTTT-TAMRA-3 ′. Сондите и праймерите за ERCC1 бяха: преден грунд, 512F, 5′-GGCGACGTAATTCCCGACt-3 ′; обратен грунд, 576R, 5′-TAGCGGAGGCTGAGGAACA-3 ′; и сонда: 5′-FAM-TGTGCTGGGCCAGAGCACCTGT-TAMRA-3 ′. Грундове и сонди са получени от Applied Biosystems.

Плазмени нива на витамин С и транс-β-каротин.

Плазмените нива на витамин С и каротеноиди, включително транс-β-каротин, са анализирани, както е съобщено по-рано (23, 24). Пълно покритие на редуванията в концентрацията на плазмени антиоксиданти в трите групи ще бъде публикувано другаде.

Статистика.

Резултати

В началото консумацията на енергия от въглехидрати, мазнини и протеини не се различава между групите. Няма разлика в консумацията на алкохол или приема на плодове и зеленчуци между групите (Таблица 1) ⇓. Определено от изходните кръвни проби, плазменото съдържание на витамин С и β-каротин не се различава между групите (Таблица 1) ⇓. Също така, няма разлика в нивото на биомаркери на окислително увреждане на ДНК и възстановяване между групите на изходно ниво. Следователно това показва, че рандомизацията е била успешна.

По време на интервенционния период плазмените концентрации на витамин С и β-каротин са намалени съответно с 69 и 47% в групата на плацебо, докато високите плазмени концентрации на витамин С се поддържат в групата на плодовете и зеленчуците и допълваните групи (Таблица 3 ) ⇓. Плазменият β-каротин е увеличен в групата на плодовете и зеленчуците и в групата на витаминните таблетки след 3 седмици поглъщане.

Плазмени концентрации на витамин С и β-каротин на изходно ниво и на 24-ия ден след 3 седмици на интервенция (средно и SD)

Стационарно ниво на увреждане на окислителната ДНК в мононуклеарни кръвни клетки (анализ на комети).

Всяко измерване на пробата включва прекъсвания на стойката и чувствителност към H2O2, както и оксидативно увреждане на ДНК, открито от ENDOIII и FPG (Таблица 4) ⇓. Нито една от крайните точки не е засегната от диетичната интервенция. Опитваха се различни видове стандартизация (т.е. изваждания между пробите и контролите), но това не предполага, че ежедневните вариации маскират биологичните ефекти на анализа. Статистическият анализ показва ефект на H2O2-индуцирани щети на 16-ия ден във всички групи (P Вижте тази таблица:

  • Преглед на линия
  • Преглед на изскачащия прозорец

Ниво на счупване на веригата на ДНК, чувствителни към ENDOIII и FPG места и чувствителност към водороден пероксид в мононуклеарни кръвни клетки, открити от анализа на кометата (средно и SD) a, b

За всеки цикъл на електрофореза включихме криоконсервирани мононуклеарни кръвни клетки за откриване на скъсвания на вериги и третиране с H2O2 (150 μ m). Средната стойност и SD беше 29 ± 11 за прекъсвания на вериги и 93 ± 21 за третирани с H2O2 клетки (n = 32). FPG-чувствителните места в мононуклеарни клетки са 62 ± 24, а средната стойност и SD на прясно третирани с H2O2 (150 μ m) мононуклеарни клетки са 52 ± 16 (n = 32). Вариацията на прекъсванията на веригите е подобна на съобщената по-рано вариация на анализа (14) и вариацията на анализа, докладвана в други проучвания за биомониторинг (25, 26, 27) .

Екскреция на 8-OxodG с урината.

Няма разлика в екскрецията на 8-oxodG между трите консумирани диети (Таблица 5) ⇓. Имаше обаче ефект от периода, при който пробите, взети след интервенционния период, бяха по-ниски, отколкото през останалите времена за вземане на проби (P Вижте тази таблица:

  • Преглед на линия
  • Преглед на изскачащия прозорец

Ниво на 24 часа екскреция на 8-oxodG с урината (средно и SD) a

Изрази на OGG1 и ERCC1 иРНК в левкоцити.

Изразите на OGG1 и ERCC1 са посочени в Таблица 6 ⇓. Експресията на mRNA на OGG1 и ERCC1 беше определена на 9 различни дни по време на проучването. Описанието на пълния набор от данни за изразите на иРНК е докладвано другаде (22). Представените тук данни само очертават изразите за 5-те дни с анализ на комети и измервания на екскреция на 8-oxodG в урината. Нивата на експресия на иРНК на двата гена за възстановяване на ДНК не са свързани с консумираната диета и няма ефект от пола.

Експресия на mRNA на OGG1 и ERCC1 спрямо 18S в левкоцити, изолирани от пълноценна кръв (средно и SD с брой участници в скоби) a, b

Корелации.

Няма значими корелационни връзки между 8-oxodG в урината и крайни точки за анализ на комети, 8-oxodG в урината и експресия на гени за възстановяване на ДНК, и крайни точки в анализ на комети и експресия на гени за възстановяване на ДНК.

Дискусия

В това проучване установихме, че изчерпването на плодовете и зеленчуците или консумацията на 600 g плодове и зеленчуци или съответното количество витамини и минерали, дадени като добавка за 24 дни, не променят нивото на скъсване на нишките, окислителната ДНК базово увреждане или чувствителност към H2O2 в мононуклеарните кръвни клетки. Експресиите на гени за възстановяване на ДНК, участващи в възстановяването на базата на ексцизия (OGG1) и възстановяването на нуклеотиди (ERCC1), са непроменени от консумираната диета, което предполага, че непроменените нива на окислително увреждане на ДНК не се дължат на промяна в дейността за възстановяване на ДНК Тази идея е допълнително подсилена от непроменените екскреции на 8-oxodG в урината, които представляват сумата от 8-oxodG възстановяване, саниране на нуклеотидния пул, клетъчен оборот и митохондриален оборот в цялото тяло (7). Колективно, нашите данни категорично предполагат, че излишъкът от окислително увреждане на ДНК не е произведен при лица по време на ниския прием на антиоксиданти.

В заключение, това 24-дневно интервенционно проучване за плодове и зеленчуци не показа благоприятни ефекти върху окислителното увреждане на ДНК или експресията на гени за възстановяване на ДНК. Това може да предполага, че антиоксидантните свойства или ефекти върху окислителното увреждане на ДНК играят малка или никаква роля в превантивния ефект на рака при плодовете и зеленчуците. Като алтернатива е възможно участниците, включени в проучването, да не са били изложени на какъвто и да е вид оксидативен стрес, който би причинил оксидативно увреждане. Също така трябва да се вземе предвид, че субектите, избрани за изследването, са имали относително висок прием на плодове и зеленчуци и не са пушачи. Необходими са допълнителни проучвания за ефекта на плодовете и зеленчуците върху окислителното увреждане на ДНК в ситуации на оксидативен стрес, за да се подкрепи ролята на плодовете и зеленчуците в превенцията на рака.

Бележка, добавена в доказателство.

След подаване на тази статия, Collins et al. (Carcinogenesis (Lond.) 24: 511–515, 2003) са първите изследователи, публикували данни за експресията на OGG1 mRNA във връзка с приема на плодове киви.