Допринесъл еднакво за тази работа с: Джоузеф Т. Девър, Майкъл К. Кемп, Дейвид М. Барнс

разнообразие

Отдел за изследвания и развитие на партньорството, Standard Process, Inc., Палмира, Уисконсин, Съединени американски щати

Допринесъл еднакво за тази работа с: Джоузеф Т. Девър, Майкъл К. Кемп, Дейвид М. Барнс

Отдел за изследвания и развитие на партньорството, Standard Process, Inc., Палмира, Уисконсин, Съединени американски щати

Authors ‡ Тези автори също допринесоха еднакво за тази работа.

Отдел за изследвания и развитие на партньорството, Standard Process, Inc., Палмира, Уисконсин, Съединени американски щати

Authors ‡ Тези автори също допринесоха еднакво за тази работа.

Отдел за изследвания и развитие на партньорството, Standard Process, Inc., Палмира, Уисконсин, Съединени американски щати

Authors ‡ Тези автори също допринесоха еднакво за тази работа.

Отдел за изследвания и развитие на партньорството, Standard Process, Inc., Палмира, Уисконсин, Съединени американски щати

Authors ‡ Тези автори също допринесоха еднакво за тази работа.

Отдел за изследвания и развитие на партньорството, Standard Process, Inc., Палмира, Уисконсин, Съединени американски щати

Допринесъл еднакво за тази работа с: Джоузеф Т. Девър, Майкъл К. Кемп, Дейвид М. Барнс

Отдел за изследвания и развитие на партньорството, Standard Process, Inc., Палмира, Уисконсин, Съединени американски щати

  • Джоузеф Т. Девър,
  • Майкъл К. Кемп,
  • Амбър Л. Томпсън,
  • Хана Г. К. Келер,
  • Джеймс К. Ваксмонски,
  • Крис Д. Шол,
  • Дейвид М. Барнс

Фигури

Резюме

Цитат: Dever JT, Kemp MQ, Thompson AL, Keller HGK, Waksmonski JC, Scholl CD, et al. (2015) Оцеляване и разнообразие на човешките хомоложни диетични микроРНК в екстракти от конвенционално готвено филе и сушени говежди тъкани. PLoS ONE 10 (9): e0138275. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0138275

Редактор: Юн Джън, Университет за наука и технологии в Кунмин, КИТАЙ

Получено: 28 април 2015 г .; Прието: 26 август 2015 г .; Публикувано: 22 септември 2015 г.

Наличност на данни: Всички съответни данни се съдържат в хартията и нейните поддържащи информационни файлове. Депозирали сме всички малки профили за секвениране на РНК, споменати в ръкописа, в NCBI GEO/SRA. Номерът за присъединяване на GEO за изследването е GSE69874.

Финансиране: Standard Process, Inc. финансира тази работа. Финансистът осигури подкрепа под формата на заплати за всички автори, но нямаше никаква допълнителна роля в дизайна на изследването, събирането и анализа на данни, решението за публикуване или подготовката на ръкописа.

Конкуриращи се интереси: Авторите потвърждават, че всички автори са служители на Standard Process, Inc. Авторите също така декларират, че „Standard Process, Inc. предлага на пазара консумативи с произход от животински тъкани, но това не променя тяхното придържане към PLOS ONE политиките за споделяне на данни и материали.

Въведение

МикроРНК (miRNA) са повсеместен клас малки некодиращи РНК при растения и животни, които инхибират протеиновата транслация на пратеника РНК (mRNA) чрез антисмислово свързване [1]. В момента над 2500 човешки miRNA са включени в miRBase (версия 21) [2] и техният регулаторен ефект върху клетъчните и физиологични процеси е широко разпространен. Зрели, едноверижни miRNAs, обикновено 22 нуклеотида на дължина, се получават от по-дълги предшественици на фиби чрез разцепване от Drosha и Dicer [1]. След това те са обвързани с Argonaute 2 като част от РНК-заглушаващия комплекс, който улеснява свързването на miRNAs с техните иРНК цели.

В това проучване ние използвахме дълбоко miRNA секвениране и количествена PCR с обратна транскрипция (RT-qPCR), за да характеризираме профила и стабилността на човешки хомоложни говежди miRNAs в хранителни говежди тъкани, включително горен филе, сърце и надбъбреци. Тествахме ефекта от конвенционалното готвене (пържене на тиган) или пастьоризация, последвано от лиофилно изсушаване на течни тъканни екстракти върху тъканните miRNAs. Общата ни цел беше да предоставим необходимата информация за състава, необходима за по-широките усилия за определяне дали miRNA на месо са хранително значими.

Методи

Събиране на проби

Изследваните говежди мускулни и органни тъкани са с качество на Министерството на земеделието на САЩ и са подходящи за консумация от човека. Месните продукти не са състарени и са получени от съвкупност от породи. Прясно нарязани проби от топ филе (по 12–15 паунда) са получени от хранителни магазини в южната централна част на Уисконсин (WI), включително Walmart Supercenter (Monona, WI), Piggly Wiggly (Cambridge, WI) и Pick 'n Save (Fort Atkinson, WI). Говежди сърца (Long Prairie Packing, Long Prairie, MN, Federal Establishment # 253) и говежди надбъбреци (Cargill Wyalusing, Wyalusing, PA, Federal Establishment # 9400) бяха закупени директно от инспектирани от Министерството на земеделието щати съоръжения. Всяка органна проба се състои от обединени тъкани (12–15 паунда всяка) от множество животни.

Приготвяне на пробата

Пробите от филе, сърце и надбъбреци първоначално са били смлени с помощта на месомелачка STX Turbo Force. За да се приготвят конвенционално приготвени тъканни проби, смлените тъкани се изпържват на тиган (без останало розово месо) с помощта на електрически тиган, настроен на 350 ° F (177 ° C). За да се приготвят изсушени тъканни екстракти, смлената тъкан се обработва в екстракт от течна тъкан, използвайки лабораторен метод, базиран на производствен мащаб, процес на екстракция с хранителна степен (Standard Process, Inc, Palmyra, WI). След това течният екстракт от тъкан беше пастьоризиран при 72 ° С в продължение на 15 секунди и впоследствие лиофилизиран. Лиофилизираните екстракти се смилат на прах с помощта на хаванче и пестик. След това всички проби се съхраняват при -20 ° C.

Екстракция на РНК

Общата РНК беше извлечена от всяка сурова, сготвена и изсушена тъкан с помощта на mirVana ™ miRNA Isolation Kit (Life Technologies, Carlsbad, CA) в съответствие с инструкциите на производителя. Накратко, 100 mg от суровите или изпържени проби и 25 mg от изсушените екстракти се обработват с ултразвук в продължение на 5 минути в 600 μL разтвор Lysis/Binding TM, последвано от киселинно-фенолна екстракция. Общата РНК се събира в въртяща се колона и се елуира в 50-100 uL разтвор за елуиране. Количеството и чистотата бяха определени с помощта на Nanodrop ND-1000. Целостта на РНК се оценява с помощта на Bioanalyzer (Agilent, Калифорния). Пробите бяха изпратени на сух лед до Arraystar, Inc. (Rockville, MD) за секвениране.

Дълбоко miRNA секвениране

Общата РНК от всяка проба е използвана за приготвяне на библиотеката за последователност на miRNA, която включва следните стъпки: 1) 3'-адаптерно лигиране с Т4 РНК лигаза 2 (пресечена); 2) 5'-адаптерно лигиране с Т4 РНК лигаза; 3) cDNA синтез с RT праймер; 4) PCR амплификация; 5) извличане и пречистване на

135–155 bp PCR амплифицирани фрагменти (съответстват на

15–35 nt малки РНК) от гела PAGE. След като завършените библиотеки бяха количествено определени с биоанализатор Agilent 2100, фрагментите на ДНК в библиотеките бяха денатурирани с 0,1 М NaOH, за да се генерират едноверижни ДНК молекули, уловени върху поточни клетки на Illumina, амплифицирани in situ и накрая секвенирани в продължение на 36 цикъла на Illumina HiSeq ® 2000 според инструкциите на производителя. След генериране на изображения за секвениране, анализът на изображенията и базовото извикване бяха извършени с помощта на софтуера Off-Line Basecaller (OLB V1.8.0). Впоследствие 3 ’адаптерни последователности бяха изрязани от чисти четения (четения, преминали през Solexa CHASTITY качествен филтър) и четенията, по-кратки от 15nt, бяха изхвърлени. 3-адапторът-подстригани четения (> = 15nt) бяха подравнени с най-новия известен набор от прекурсори на miRNA за крави и хора (Sanger miRBase 20), използвайки Novoalign (v2.07.11). Чете (брои Фигура 1. Резултати от последователността.

А) Представителни изображения на общата РНК от всяка сурова и подготвена тъкан след електрофоретично разделяне. Б) Процентът на отчетените с адаптер четения, отбелязани като говежди или човешки miRNAs. В) Графики на честотата на четене за сурови и подготвени тъкани. Данните се изразяват като средна стойност ± SD, * значително различна (p Фиг. 2. Корелационен и едновариатен анализ на miRNA профили.

Карта на корелационната топлина на осредненото log2 трансформирано нормализирано отчитане на 198 miRNAs, открити при 10 или по-големи четения във всичките три повторения на поне една тъкан и процес. Броят на значително различни miRNAs (p Фиг. 3. Мултивариатен анализ на miRNA профили.

А) Принципен компонент анализ и Б) йерархично клъстериране на log2 трансформирани нормализирани отчитания на 105 диференциално открити miRNAs, определени от ANOVA.

Влияние на методите за подготовка на тъканите върху хранителните miRNAs

След това изследвахме идентичността и относителния принос на специфични човешки хомоложни miRNAs за всяка сурова и подготвена тъкан. Във всички случаи десетте най-разпространени miRNAs съставляват по-голямата част (71–93%) от общите средно нормализирани показания, анотирани от miRNA (Таблица S3, Фигура 4). Профилите на miRNA на варено филе, варено сърце и екстракт от сърце бяха много подобни на съответните им сурови тъкани. За разлика от това, профилът на 10-те най-разпространени miRNAs в сготвен надбъбречен и надбъбречен екстракт се различава донякъде от суровия надбъбрек, съдържащ приблизително половината от същите 10 най-разпространени miRNAs от сурови тъкани. Две miRNAs, miR-10b-5p и miR-143-3p, бяха сред най-изразените miRNAs във всички препарати на трите тъкани, докато miR-26a-5p и miR-30a-5p също бяха в първите десет miRNAs във всички групи с изключение на сготвена надбъбречна жлеза. Специфичният за мускулите miR-1 беше виден при филетата и препаратите на основата на сърце, докато miR-206, друга специфична за мускулите miRNA, беше преобладаваща както в суровия, така и в готвения филе. Във всички групи, базирани на надбъбречните жлези, miR-146b-5p е открит при по-висок брой четци в сравнение с филе и сърдечни групи.

Средният процент принос към общия анотиран от човека miRNA профил на 10-те най-разпространени miRNAs във всяка тъкан и група процеси. МиРНК на сурови тъкани получиха уникален цвят. Всички miRNAs с бял фон присъстват сред 10-те най-разпространени miRNAs в проби от варени или изсушени екстракти, но не и в съответната сурова тъкан.

Количествена обратна транскрипция PCR (RT-qPCR) валидиране на резултатите от дълбокото секвениране

Резултатите от секвенирането от суровите и подготвени тъкани бяха валидирани чрез RT-qPCR, използвайки анализи Taqman®. Първо потвърдихме две miRNAs (miR-10b-5p и miR-143-3p), които бяха повсеместно открити във всички секвенирани проби. Наблюдавана е значителна корелация между log10-трансформираните отчитания (3.2–5.7) и стойностите на Ct (22.6–35.3) и за двете от тези miRNAs (фиг. 5). Също така потвърдихме три miRNAs, открити при по-висок брой на четене в филе (miR-206), сърце (miR-221-3p) и надбъбреци (miR-146b-5p). Във всеки случай са получени по-ниски стойности на Ct (съответстващи на по-висока експресия) в очакваната тъкан (Фигура 5). Накрая потвърдихме две miRNAs (miR-506 и miR-889), които не бяха открити в никоя проба чрез секвениране. Както се очаква, RT-qPCR анализ на тези miRNAs в филе, сърце и надбъбречни суровини и подготвени проби потвърди липсата или почти липсата на тези miRNAs (Ct стойности над 36 или неопределени).

А) Корелационният анализ на Pearson на log10 нормализирано секвениране отчита със стойности Ct за miR-10b-5p и miR-143-3p в тъканни и процесни групи. Б) Ct стойности за miR-206, miR-221-3p и miR-146-5p в тъканни и процесни групи. Данните са изразени като средни стойности ± SD, * значително различни (p + CD25 + FoxP3 + регулаторни Т клетки [15]. Тази хипотеза сега е допълнително подкрепена от неотдавнашни открития, че миРНК от говеда от мляко наистина се абсорбира от мишки, както и от хора в системната циркулация [14].

Тук показахме чрез дълбоко секвениране и RT-qPCR, че в допълнение към млякото, разнообразни и специфични за тъканите модели на човешки хомоложни miRNAs също присъстват както в конвенционално приготвено говеждо месо, така и в изсушени тъкани. Доколкото ни е известно, тези открития представляват първото усилие за каталогизиране на пълния профил на човешки хомоложни диетични miRNAs в консумативни животински тъкани.

Все повече доказателства предполагат, че абсорбцията на хранителни miRNAs в системната циркулация след перорален прием не винаги може да бъде ефективна при бозайници [5–7,10]. Тези, защитени в екзозомите или свързани с протеини, могат да бъдат по-стабилни и бионалични [11–15, 22–24]. Дори и да не се абсорбират добре в системната циркулация, хранителните miRNAs могат да повлияят на самите черва. Например, имунологично базирани диетични miRNAs, като тези, които се намират в млякото, могат да упражняват ефекти в лимфоидната тъкан, свързана с червата.

Едно важно ограничение на настоящото изследване е, че сме предоставили само относително, а не абсолютно количествено определяне на miRNAs на базата на месо. Нашата основна цел беше широко характеризиране на стабилността и разнообразието на хранителните miRNAs в ядливите животински тъкани. Тези данни вече могат да се използват като основа, от която да се избират хранителни miRNAs от особен интерес за количествен анализ, усилие, което сега е много по-осъществимо с появата на капковата цифрова PCR технология. Точното определяне на нетната доза диетични miRNAs в хранителни животински продукти, както и тяхната бионаличност ще бъде от съществено значение за пълната оценка на тяхната хранителна значимост.

В заключение ние идентифицирахме многобройни човешки хомоложни диетични miRNAs в готвено топ филе и сушени екстракти от говежди тъкани. Установено е, че всяка тъкан съдържа уникален профил на miRNAs и тези профили остават до голяма степен непокътнати след конвенционално пържене на тиган и светкавична пастьоризация. Тези miRNAs могат да се считат за уникални съставки на годни за консумация животински тъкани, но ще са необходими допълнителни експерименти за определяне на точните им хранителни ефекти.