Въпрос:

Как да определим молекулярното тегло на протеина със SDS-страница?

определяне

Човекът с протеини казва:

Как можете да оцените молекулното тегло на неизвестен протеин? Е, можете да го направите, като използвате метода SDS-PAGE (натриев додецил сулфат полиакриламиден гел електрофореза). Въпреки че има някои други методи (т.е. аналитично ултрацентрифугиране и разсейване на светлина) за изчисляване на размера или молекулното тегло (MW) на неизвестен протеин, те не се използват често за тази цел, тъй като те използват големи количества високо пречистени протеини и изискват скъпо оборудване.

SDS-PAGE за определяне на молекулярното тегло: Преглед на процеса

За да определите молекулното тегло на неизвестен протеин, трябва да разделите пробата на същия гел с набор от стандарти за молекулно тегло. След пускане на стандартите и неизвестната протеинова проба, гелът се обработва с желаното оцветяване и след това се оцветява за около 12 до 14 часа, за да се визуализират протеиновите ленти.

След като пуснете гела, трябва да определите относителното разстояние на миграция (Rf) на протеиновите стандарти и неизвестния протеин. Разстоянието на миграция може да се определи, като се използва следното уравнение:

Rf = разстоянието на миграция на протеина
Миграционно разстояние на фронта на багрилото

Забележка: Можете да използвате линийка за измерване на разстоянието на миграция (в сантиметри) от горната част на гела до всяка основна лента в гела. Като алтернатива може да се използва и подходящ софтуер за определяне на Rf стойностите на получените ленти.

Въз основа на стойностите, получени за лентите в стандарта, логаритъмът на молекулното тегло на SDS-денатурирания полипептид и неговото относително миграционно разстояние (Rf) се нанася в графика. Моля, обърнете внимание, че ще генерирате линеен график за повечето протеини, ако вашите проби са напълно денатурирани и процентът на гел е подходящ за диапазона на молекулното тегло на пробата. Ако получите сигмоидална крива, това означава, че пресяващият ефект на вашата матрица е или твърде голям, че ограничава проникването на молекулите в гела или е почти незначителен, че позволява на протеиновите молекули да мигрират почти при свободната си подвижност.

Интерполирането на стойността от тази графика ще ви даде молекулното тегло на неизвестната протеинова лента. Моля, обърнете внимание, че точността на този метод при определяне на молекулното тегло на неизвестен протеин обикновено варира от 5% до 10%. Наличието на полипептиди като гликол и липопротеини обикновено води до грешни резултати, тъй като те не са напълно покрити със SDS и по този начин не биха се държали както се очаква.

Така че за примера на снимката неизвестният протеин има Rf 0,7084. Използвайки уравнението за линейния график, можем да изчислим Log (MW). (-2,0742 х 0,7084) +2,8 = 1,3305. Така че обратният логаритъм е 10 ^ 1.3305 = 21.4kDa за молекулното тегло на неизвестния протеин.

Създаване на идеални условия за разделяне: Някои фактори, които трябва да се имат предвид

Предвид значението му при определяне на молекулното тегло на неизвестна протеинова проба, трябва да изберете подходящите условия за разделяне, когато правите експеримента си. За да направите това, трябва да вземете предвид следните фактори:

Стандартният протеин и неизвестният протеин трябва да бъдат електрофорезирани върху един и същ гел при идентични условия.

Трябва да се генерират множество точки от данни, за да се гарантира, че данните носят статистическа значимост. За най-добри резултати опитайте да използвате поне три гела.

При разтварянето на протеините, пробният буфер трябва да съдържа редуциращи агенти като дитиотреитол или В-меркаптоетанол, за да се гарантира, че дисулфидните връзки ще се разкъсат. Както може би вече знаете, дисулфидните връзки намаляват ефекта на вторичната структура върху миграцията.

Буферът за проби също трябва да съдържа SDS. SDS се свързва с хидрофобни протеинови области, за да денатурира вторични, третични и четвъртични структури и дава нетен отрицателен заряд върху протеините. SDS кара протеините да се разгъват до произволни, подобни на пръчки вериги, без да прекъсват ковалентни връзки в процеса. Това кара протеините да губят биологичните си функции, без да увреждат основните си структури.

Имайте предвид, че неизвестният протеин трябва да бъде в линейния диапазон на стандартната крива, за да позволи точното определяне на молекулното му тегло. Освен това количеството на неизвестния протеин трябва да съответства на съответния стандарт, за да се увеличи точността на резултатите.