• Намерете този автор в Google Scholar
  • Намерете този автор в PubMed
  • Потърсете този автор на този сайт
  • За кореспонденция: jyseoh @ ewha.ac.krmbit @ ewha.ac.kr

Резюме

Затлъстяването е болестта, натрупваща излишни мазнини в тялото. Разпространението на затлъстяването и свързаните с него метаболитни нарушения се увеличава всяка година в световен мащаб. Имунологично затлъстяването е хронично нискостепенно възпалително състояние с увеличаване на M1 макрофагите и намаляване на регулаторните Т клетки (Tregs). Известно е, че комплексът IL-2/anti-IL-2 (IL-2C) и хипербаричният кислород (HBO) разширяват Tregs in vivo и потискат възпалението. Следователно в това проучване са изследвани IL-2C и HBO за превантивния ефект на затлъстяването и свързаните с него метаболитни нарушения. Мъжки мишки C57BL/6 са били хранени с диета с високо съдържание на мазнини (HFD) в продължение на 16 седмици, а колегите са били хранени с диета с ниско съдържание на мазнини (LFD). В края на експеримента повишаването на телесното тегло и нарушеният метаболизъм на глюкозата, повишените нива на инсулин и общия холестерол, индуцирани от HFD, се подобряват от индивидуалното или комбинирано лечение с Il-2C и HBO. Хистологичното изследване на епидидималната бяла мастна тъкан показва адипоцитна хипертрофия и много короноподобни структури в контролните групи с HFD. В допълнение, черният дроб показва прогресия на безалкохолната мастна чернодробна болест (NAFLD) в контролните групи с HFD, но тя е значително подобрена от индивидуалното или комбинирано лечение с IL-2C и HBO.

отслабване

Що се отнася до основния механизъм, възпалението, индуцирано от затлъстяване, беше намалено и експресията на HIF-1α чрез адипоцитна хипертрофия също беше намалена от индивидуалното или комбинирано лечение с IL-2C и HBO. В допълнение, кафявото на мастната тъкан се активира в кафява и ингвинална мастна тъкан и експресията на UCP-1, участваща в термогенезата, се увеличава от индивидуалното или комбинирано лечение с IL-2C и HBO. Като цяло тези резултати предполагат, че IL-2C и HBO може да са нова обещаваща имунотерапия за лечение на затлъстяване и свързаните с него метаболитни нарушения чрез регулиране на възпалението и активиране на потъмняване на мастната тъкан.

Въведение

Затлъстяването произтича от дисбаланс между усвояването и потреблението на енергия [1]. Това е състоянието на прекомерно натрупани мазнини в организма и причинява много неблагоприятни ефекти върху здравето. СЗО съобщава, че над 1,9 милиарда възрастни са с наднормено тегло и от тях над 650 милиона са били със затлъстяване през 2016 г. [2]. В днешно време този проблем става все по-сериозен, тъй като затлъстяването става все по-разпространено при децата и юношите [3]. Затлъстяването е свързано с различни метаболитни нарушения, включително диабет тип 2 [4] и безалкохолна мастна чернодробна болест (NAFLD) [5], съдови заболявания, включително атеросклероза [6] и сърдечно-съдови заболявания [7] и няколко ракови заболявания [8]. В крайна сметка затлъстяването съкращава продължителността на живота. За лечение на затлъстяването най-ефективният и безопасен метод е промяната на диетичния режим и начина на живот [9], но това не е лесно. В сериозни случаи се обмислят медицински и дори хирургични интервенции [10]. Има обаче много странични ефекти и усложнения [11, 12] и по този начин все още е необходимо да се разработят по-безопасни алтернативни методи за лечение на затлъстяването.

По този начин, както IL-2C, така и HBO могат да разширят Tregs и да потиснат хроничния нискостепенен възпалителен статус при затлъстяване и може да се очаква синергия. Следователно, в настоящото проучване, индивидуалното или комбинирано лечение на IL-2C и HBO са изследвани за превантивни ефекти върху затлъстяването и свързаните с него метаболитни нарушения, предизвикани от диета с високо съдържание на мазнини.

Материали и методи

Това проучване е одобрено от Институционалния комитет по грижа и употреба на животните към Университетския университет по медицина Ewha Womans (номер на одобрение на IACUC: 14-0263). Мишки (C57BL/6, мъжки, на 6 седмици) са закупени от Central Lab Animal Inc. (Сеул, Корея). Мишките бяха настанени в специфично съоръжение без патогени в университета Ewha Womans. За грижа за животните стая се контролира с 12-часов цикъл светлина/тъмнина, 50% влажност и свободен достъп до храна и вода, обработени с γ-облъчване.

Експеримент с животни

В експеримента бяха използвани седемседмични мъжки мишки C57BL/6J. Мишките са хранени с диета с високо съдържание на мазнини (HFD, 60 kcal% мазнини, 5,24 kcal/g, D12492, Research Diets, New Brunswick, NJ, USA) или диета с ниско съдържание на мазнини (LFD, 10 kcal% мазнини, 3.85 kcal/g, D12450B, Research Diets) за 16 седмици. Специфичната цел на този експеримент е да се изследва дали IL-2C и/или хипербарен кислород (HBO), за които е известно, че разширяват Tregs in vivo, отслабват индуцираното от HFD затлъстяване и свързаните с него метаболитни нарушения.

Изследване на метаболизма на глюкозата

За тестовете за толерантност към глюкозата (GTT), мишките бяха интраперитонеално (IP) инжектирани с 2 g/kg глюкоза (Sigma Aldrich, Saint Louis, MO, USA) след гладуване в продължение на 15 часа. Нивата на кръвната захар се измерват с глюкомер (комплект Accu-Check Performa, Roche, Базел, Швейцария) на 0, 15, 30, 60 и 120 минути. За тестовете за инсулинов толеранс (ITT), на мишките се прилагат IP с 0,75 IU/kg инсулин гларжин (Lantus ™, Sanofi, Париж, Франция) след гладуване в продължение на 4 часа и нивата на глюкоза в кръвта се измерват при 0, 15, 30, 60 и 120 минути. Площта под кривата (AUC) се изчислява чрез програма PRISM v5.01 (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, USA). Нивата на инсулин в серумите на гладно са измервани с помощта на инсулинов комплект ELISA (ALPCO, Salem, NH, USA).

Биохимични тестове за липиди

Серумните нива на общия холестерол (TC) и триглицеридите (TG) бяха измерени с помощта на комплект за анализ на TC и комплект за количествено определяне на серумен TG, закупен от Cell Biolabs, Inc. (Сан Диего, Калифорния, САЩ), съгласно инструкциите на производителя.

Хистология

H&E, трихром на Masson, оцветяване с маслено червено и микроскопски анализ

Разрязаната тъкан се фиксира в 10% формалин. Серийни секции (4 μm) бяха монтирани върху предметни стъкла и оцветени с хематоксилин и еозин (H&E). Размерът на адипоцитите и броят на eWAT, както и дебелината на предния подкожен WAT са измерени с програма Image J (National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA).

Трихромовото оцветяване на Masson се прилага за откриване на колагенови влакна в чернодробните тъкани. Вградените в парафин чернодробни секции се оцветяват с работен разтвор на хематоксилин на желязо на Weigert (Polysciences inc., Warrington, PA, USA) в продължение на 10 минути и след това с разтвор на фуксин от червена киселина Biebrich (Sigma Aldrich) в продължение на 10 минути. След измиване с D.W., срезовете се диференцират в разтвор на фосфомолибди-фосфотунгстикова киселина (Sigma Aldrich) в продължение на 10 минути и се оцветяват с анилинов син разтвор (Sigma Aldrich) в продължение на 5 минути. След това тъканните проби бяха дехидратирани и монтирани.

Маслено червено O оцветяване се прилага за оценка на натрупването на мазнини в черния дроб. Прясно дисектирани чернодробни тъкани бяха вградени в Tissue-Tek O.C.T. съединение (Thermo Fisher Scientific, МА, САЩ) и бяха замразени при -196,5 ° С. Замразените секции (дебелина 10 μm) бяха приготвени и изсушени с въздух. Плъзгачите се изплакват с 60% изопропанол (Sigma Aldrich) и се оцветяват с маслено червен О разтвор (Sigma Aldrich) в продължение на 15 минути. Слайдовете се изплакват отново с 60% изопропанол и се оцветяват със стипца хематоксилин (Polysciences inc.). Слайдовете бяха изплакнати с D.W. и бяха монтирани с воден разтвор за монтиране (Thermo Fisher Scientific).

За оценка на оценката за активност на NAFLD (NAS) бяха изследвани произволно избрани 3 независими изображения и оценени за стеатоза, лобуларно възпаление и балониране. NAS се изчислява чрез сумата от оценки за стеатоза (0 - 3), лобуларно възпаление (0 - 3) и балониране на хепатоцитите (0 - 2), а общата оценка варира от 0 до 8 [42].

Имунохистохимия и количествено определяне на нивата на експресия

Вградените в парафин тъканни участъци (4 μm) бяха хидратирани в етанол и D.W. Плъзгащите се тъкани се нагряват във вряща вода за извличане на антигени в продължение на 10 - 20 минути. Ендогенната пероксидаза беше блокирана чрез третиране с H2O2, съдържащ реагент за блокиране на пероксидаза (DAKO, Санта Клара, Калифорния, САЩ) в продължение на 10 минути на тъмно. След измиване срезите бяха третирани с тези първични антитела като F4/80 (Abcam, Cambridge, UK, 1: 100 разреждания), HIF-1α (Bethyl Laboratories, Inc., Montgomery, TX, USA, 1: 100 разреждания), UCP-1 (Abcam, 1: 4000 разреждания) в продължение на 1-2 часа при RT и след това се обработва с HRP полимер (Cell Signaling Technology, Inc., МА, САЩ) в продължение на 30 минути. След това срезовете бяха третирани с DAB хромоген (Biocare Medical, Pacheco, CA, USA) в продължение на 5 минути при RT на тъмно и след това спряни от D.W. Слайдовете се оцветяват с хематоксилин за 5 секунди. Тъканната проба беше дехидратирана и монтирана.

За количествения анализ на експресията на HIF-1α, слайдовете бяха приложени за сканиране на цели слайдове с висока разделителна способност, използвайки Vectra Polaris (PerkinElmer Inc., Hopkinton, MA, USA). Областите за анализ бяха избрани на случаен принцип 3 - 5 петна и приложени към inForm (Image Analysis Software, Perkin Elmer). Мастната и чернодробната тъкани бяха избрани чрез алгоритъм за тъканна и празна сегментация. Сред тези области на тъканите се извършва сегментация на клетките по интензитет на ядрото и клетъчна морфология. InForm генерира отчети за интензивността за DAB маркери от всяка анализирана клетка. DAB положителните клетки бяха измерени в избраните 3 - 5 изображения на група при разделителната способност на X10 в eWAT и X20 в черния дроб.

Проточна цитометрия

Статистически анализ

Резултатите са представени като средната стойност ± SEM. Статистическата значимост беше оценена с t-тест и двупосочен ANOVA. Значимостта е определена на * p-та седмица и разликата между групите става постепенно по-забележима до края на експеримента (S1 Фиг.). В края на експеримента телесното тегло в групите, третирани с индивида или комбинация от IL-2C и HBO, са значително по-ниски от тези в контролите на групата с HFD (Фигура 1А). В групите с LFD, в края на експеримента, телесното тегло в групата чрез индивидуално лечение с IL-2C и комбинирано лечение също бяха значително по-ниски от тези в контролите. Телесното тегло в групата при индивидуално лечение с HBO също е по-ниско, но не е статистически значимо. Няма значителна разлика в приема на храна между експерименталните групи (Фигура 1В).