Отметка/Търсене в тази публикация

Входна версия:

Цитат:

AttachmentSize
Amylase_Ver2.pdf 380,31 KB
Amylase_Ver1.pdf 1,89 MB

Ген Символ: AMY1, AMY2

панкреапедия

1. Общ преглед (Общи)

α-амилазата (1,4-α-D-глюкан-глюканохидролаза, EC 3.2.1.1) е основният храносмилателен ензим, действащ върху нишестето или гликогена и присъства в растенията, животните, бактериите и гъбите. Нишестето от растения е високомолекулен полимер на глюкозата. Състои се от амилоза, α-1,4-свързан полимер с права верига от около 10 5 единици и амилопектин, разклонен полимер с α-1,4-свързана глюкоза с разклонени точки, изградени от α-1,6 връзки който съдържа общо около 10 6 единици глюкоза. Гликогенът от животни е подобен на амилопектин по структура, но е по-малък. α-амилазата разцепва α-1,4 връзката, когато тя не е до точката на разклоняване или крайния глюкозен остатък. По този начин неговите продукти са малтоза (2 глюкозни остатъка), малтотриоза (3 глюкозни остатъка) и α-гранични декстрини (5-6 остатъка, които съдържат точка на разклоняване). При гръбначните животни те допълнително се разцепват до монозахариди от граничните ензими на чревната четка изомалтаза и малтаза (глюкоамилаза), които хидролизират съответно α-1,6 и α-1,4 връзките (3). Проучванията показват, че хидролизата, а не абсорбцията на монозахариди е ограничаващата скоростта стъпка в сложната абсорбция на въглехидрати при хората (25).

При животни α-амилазата се среща в панкреаса, паротидите, черния дроб, серума, урината и понякога в по-малки количества в други тъкани или тумори; основните слюнчени и панкреатични амилазни протеини са много сходни (56). Слюнчената амилаза инициира храносмилането на въглехидрати в устата, а амилазата на панкреаса е основният ензим за луминално усвояване на въглехидратите в тънките черва. Човешката панкреатична а-амилаза се синтезира като протеин от 57 KDa, за който кДНК прогнозира протеин от 512 аминокиселини (66). Това включва сигнална последователност; амилазата, изолирана от човешкия панкреатичен сок, има 496 аминокиселини (20). При различни видове отчетеното молекулно тегло за амилаза е 50-57 kDa и се състои от едноверижен протеин с един въглехидрат (някои видове имат изоформа без) и изоелектрична точка 7.1. (47). Човешкият панкреатичен сок амилаза няма захарни групи и съществува като две изоформи на pI 7.2 и 6.6, наречени HPA I и HPA II (20). Пет дисулфидни моста са описани в свински панкреатична амилаза (44) и повечето видове имат една или две свободни сулфидрилни групи.

Слюнчената амилаза е кодирана от гена AMY1, а амилазата на панкреаса - от AMY2; трета форма, присъстваща в някои тумори, се нарича AMY2B (41, 51, 68, 69). Еволюцията на семейството на амилазните гени е проследена с ретровирусно вмъкване в промотора на панкреатичен амилазен ген, който го отклонява, за да се превърне в слюнчен ген (38). Амилазата е многогенно семейство с множество гени и псевдогени в хромозома 1 при хора и хромозома 3 при мишки (24, 57). Докато повечето инбредни миши щамове експресират един вид амилаза, някои щамове (A/J, CE/J) и повечето диви мишки имат множество форми (6, 60). Интересното е, че хората от селскостопанските общества, които консумират диети с високо съдържание на нишесте, имат по-голям брой копия на гени на амилаза на слюнката (45), а големият брой копия води до повече протеини и повишено възприятие на оралното нишесте (32, 50).

Структурата на човешкия амилазен протеин е известна и съдържа три домена, наречени A, B и C, започвайки от амино терминала (9). Активният сайт се намира в домейна A; калцият се свързва с В домена и може да стабилизира активния център (10). C домейнът е глобуларен домейн с неизвестна функция. Някои амилази, включително човешка панкреатична амилаза, се алостерично активират от хлорид, който модулира рН оптимума и максималната активност (15, 35). Активният център на амилазата съдържа 5 подсайта, които свързват различни глюкозни остатъци в субстрата (52). Настоящото разбиране на ензимния механизъм за гликозидази в прегледа в (63).

Кинетичните доказателства подкрепят допълнителни места за свързване на въглехидрати (2). Някои от тях са повърхностни места за свързване, които помагат на амилазата да се свърже с гранули от нишесте (70). Скоростта на смилане на нишесте също зависи от структурата на нишестето, което е класифицирано като бързо смилаемо, бавно смилаемо и устойчиво нишесте. Храносмилането на нишестето също може да бъде повлияно от готвенето, което може да разгради нишестените гранули до разтворимо нишесте (17). Изследванията на ензимния механизъм също са се възползвали от съществуването на голямо семейство растителни протеини, инхибиращи а-амилазата (7, 58, 62). Най-добре проучените от тях са от зърна и е определена структурата на ензимно-инхибиторния комплекс (49). По-мощни инхибитори са получени от псевдоолигозакариди, от които един, псевдотетразахарид, акарбоза е одобрен за клинична употреба. Съобщава се за кристалната структура на прасетата амилаза, комплексирана с акарбоза (21). Тези псевдоолигозакаридни инхибитори, за разлика от протеиновите инхибитори, блокират всички глюкозидази, включително чревните ензими на четката, както и амилазата (53).

Установено е, че множество панкреатични ензими, включително амилаза, се абсорбират на повърхността на лигавицата на дванадесетопръстника, въпреки че могат да бъдат отмити с високо съдържание на сол (3). Показано е обаче, че амилазата специфично се свързва с N-свързани олигозахариди на гликопротеините на границата на четката и това свързване засилва амилазната активност (33). Специфични гликопротеини, свързващи амилаза, са идентифицирани като захараза-изомалтаза (SI) и SGLT1 (4). Това свързване повишава активността на SI, както и тази на амилазата, но инхибира активността на SGLT1. Авторите предполагат, че това подобрява храносмилането, но предотвратява твърде бързото усвояване на глюкозата. След свързване с граничните протеини на четката амилазата се интернализира в ентероцити, възстановявайки усвояването на глюкозата (16).

2. Панкреатична функция

Локализация, регулиране и дефицит на амилаза

Панкреатичната амилаза е подобна на други секреторни протеини и се синтезира в грубия ендоплазмен ретикулум. След това се придвижва през апарата на Голджи и се съхранява в секреторни гранули до момента, в който претърпи регулирана секреция. Имунооцветяването разкрива концентрацията му в гранулите (Фигура 1). Както при другите панкреатични ензими, количеството амилаза в панкреаса се регулира от количеството хранителен субстрат (8, 22, 55). Гризачите, които се хранят с богата на въглехидрати диета, синтезират повече амилаза, която е най-разпространеният панкреатичен храносмилателен ензим при тези видове. Този ефект се проявява на ниво транскрипция и ефектът се медиира до голяма степен от инсулина. При диабет амилазата на панкреаса пада, но може да се възстанови след лечение с инсулин (30, 61). Това е особено видно при плъхове, при които при експериментален диабет амилазата на панкреаса пада само до няколко процента от нормалното. 30 гена, отговарящ на инсулин, реагиращ елемент е идентифициран в миши Amy2-2 ген (28). Фактът, че мишките експресират повече от един функционален ген Amy2, обяснява защо общата амилаза на панкреаса не пада толкова при диабет, колкото при плъхове (18).

Фигура 1: Имунофлуоресцентна локализация на амилазата в панкреаса на мишката (зелен). Ядрата са оцветени в синьо с DAPI.

Здравите доброволци са в състояние да поемат почти 100% от нишестето. Въпреки това, при хроничен панкреатит със загуба на функционираща панкреатична тъкан, само около 90% се усвоява и абсорбира; с пълно инхибиране на амилазата това се намалява до 80-85% (31). В последния случай до 20% от въглехидратите достигат илеума и повишаването на плазмения GIP и С пептид от проинсулин се блокира. Пациенти с изолиран дефицит на амилаза са докладвани с въглехидратна малабсорбция и произтичащите от нея симптоми (37, 54). Изследваните пациенти имат интактна иРНК, но без амилазен протеин. Това е подобно на физиологичния дефицит на амилаза на панкреаса при раждането, при който липсата на симптоми се дължи отчасти на ниско съдържание на диетично нишесте, изискващо амилаза, и отчасти на действието на слюнчената амилаза. Дефицитът на амилаза може да бъде недостатъчно докладван поради леки симптоми.

Наскоро беше показано, че количеството на мРНК на панкреатичната амилаза и активността на амилазата в йеюнума на плъхове, чувствителни към въглехидрати, е свързано с диетичното окисление на глюкозата и натрупването на висцерални мазнини (5)

Серумна амилаза като мярка за функцията на панкреаса при панкреатит

Също така е важно да се знае, че панкреатитът може да възникне без повишена серумна амилаза, особено при алкохолен панкреатит или рецидивиращ хроничен панкреатит (42). В някои от тези случаи липазата е повишена. По този начин, докато амилазата все още е един от най-полезните тестове за диагностициране на остър панкреатит, тя трябва да се извършва заедно с други тестове (1), заедно с разбирането за метаболизма на амилазата.

Секрецията на амилаза като мярка за регулирана панкреатична или паротидна секреция

Инхибитори на амилазата в клиничната медицина

Инхибиторите на амилазата, особено Acarbose, псевдотетразахарид, са били използвани за лечение на диабет тип 2, когато имат умерени ефекти за намаляване на пиковата глюкоза след хранене и хемоглобина А1с. Обикновено те се използват като лекарства от втора линия, често заедно с метформин (36). Съществуват също доказателства, че Acarbose може да намали синдрома на дъмпинг след бариатрична хирургия (11). Множество естествени растителни продукти с инхибитор на амилаза са предложени или проучени като лечение на диабет, но има малко убедителни доказателства за тяхната ефективност.

3. Инструменти за изследване на амилаза

а. Антитела

Амилазните антитела са широко достъпни, но не винаги са добре тествани. Най-често се използва от Sigma-Aldrich (котка # A8273) и се отглежда при зайци, инжектирани с пречистена човешка слюнна амилаза. Той е силно специфичен, реагира както със слюнчената, така и с панкреатичната амилаза и в нашите ръце работи добре за Western Blotting, имунофлуоресценция (фиг. 1) и имунохистохимия в тъканите на гризачи, както и в човешката тъкан. Редица компании продават анти-амилазни антитела, отгледани при овце, плъхове или мишки (моноклонални), които биха позволили двойно маркиране с други заешки антитела.

б. Комплекти за анализ и реактиви

Най-използваният амилазен субстрат за анализи в изследователски лаборатории е реагентът Phadebas, който е нишесте, свързан със синьо багрило. Той е разработен от Pharmacia Diagnostics и сега се произвежда от Magle Life Sciences и се продава от Fisher Scientific. Може да се използва за измерване на амилаза в плазмата или серума, както и тази, секретирана от панкреатични и паротидни клетки, където може да се разрежда, за да се намалят разходите. Алтернативни комплекти за анализ на амилаза са EnzChek Ultra Amylase Assay, продаван от ThermoFisher, който използва като субстрат маркирано с нишесте бодипи и комплект за анализ на амилаза от Sigma-Aldrich, който използва етилидин-паранитрофенол-G7 като субстрат.