Резюме

Въведение

Хроничната хипергликемия в резултат на неуспеха на функцията и масата на панкреасните β-клетки да компенсира инсулиновата резистентност бележи началото на свързан със затлъстяването диабет тип 2 (T2D). В началото на патогенезата на затлъстяването T2D компенсаторното повишаване на функцията и/или масата на β-клетките може да се погрижи за повишено метаболитно натоварване и инсулинова резистентност. С течение на времето обаче хроничното търсене на β-клетката става изчерпателно, което води до неадекватна функционална β-клетъчна маса чрез апоптоза или загуба на идентичност и в крайна сметка до откровен T2D (1–4). Това прогресивно изчерпване на β-клетките в патогенезата на T2D доведе до концепцията, че преходната β-клетъчна почивка може да бъде полезна за лечението на T2D чрез намаляване на β-клетъчното търсене и впоследствие подобряване на функцията и/или насърчаване на оцеляването на останалите ендогенни β -клетки (5). Това има известен приоритет чрез подобряване на инсулиновата чувствителност в специфични ситуации, като гестационен диабет (6), подчертано ограничаване на калориите (7) или краткосрочно директно инхибиране на ендогенната секреция на инсулин при затлъстяване T2D (8). Въпреки това, отслабването на метаболитното търсене за подобряване на функцията на β-клетките не е изследвано в детайли на нивото на β-клетката, като се използват настоящите терапевтични подходи на T2D.

почивка

Дали неуспехът на β-клетъчната функция или намалената β-клетъчна маса е от ключово значение за появата на T2D, често се обсъжда, но при хората патогенезата на заболяването вероятно е променлива и допринася и от двете (9). За β-клетъчна дисфункция при T2D има характерна загуба на глюкозно усещане, притъпена индуцирана от първа фаза глюкозна секреция на инсулин и предполагаемо неадекватно производство на инсулин (10). За разлика от тях, моделите на затлъстели T2D мишки показват, че производството на β-клетъчен инсулин е значително повишено въпреки силно изчерпаните вътреклетъчни запаси от инсулин (11). Трябва да се отбележи, че когато панкреатичните островчета, изолирани от тези затлъстели T2D мишки, бяха инкубирани при нормална гликемия (5.6 mmol/L) през нощта, скоростта на производство на инсулин се нормализира, вътреклетъчните инсулинови секреторни гранули се попълват и индуцираната от глюкоза двуфазна секреция на инсулин се възстановява (11 ).

Изследвахме дали терапевтична стратегия за понижаване на глюкозата (чрез глюкагон-подобен пептид 1 рецептор [GLP-1R] агонист лираглутид и/или инхибиране на котранспортер 2 натрий/глюкоза [SGLT-2i] с дапаглифлозин) или инсулинов сенсибилизиращ подход (използвайки тиазолидиндион [TZD] розиглитазон самостоятелно или в комбинация с дапаглифлозин) облекчава търсенето на β-клетката in vivo в BKS.Cg-Dock7 m +/+ Lebr db/J (наричани по-долу KS db/db) мишки (екстремно модел на затлъстяване T2D поради неуспешна β-клетъчна компенсация) за възстановяване на ендогенната β-клетъчна функция. Избрахме този модел (а не полигенни или индуцирани от диета модели на диабет), тъй като той се представя с катастрофална и ранна загуба на функцията на β-клетките. По този начин, ако терапевтичната ефикасност може да се наблюдава в такъв екстремен модел, ние очакваме, че тя ще се простира и до по-малко вредни патофизиологии на същото заболяване. Освен това използвахме постни мишки C57BLKS/J като сравнителни контроли. Нашите открития подчертават, че понижаването на гликемията с установени T2D терапии, особено в комбинация, също може да стимулира β-клетъчната почивка in vivo, като използва присъщата адаптивна гъвкавост на β-клетките, за да подобри техния секреторен капацитет и функция, като по този начин забавя прогресията на заболяването.

Изследователски дизайн и методи

Експериментален дизайн

ipGTT

Шестчасови гладни мишки се инжектират интраперитонеално с 1,5 g/kg глюкоза във физиологичен разтвор. Кръвната глюкоза се определя на 0, 5, 10, 15, 60 и 180 минути за кохорта 1 и 0, 15, 30, 60, 120 и 240 минути за кохорта 2. Нивата на циркулиращата плазмена глюкоза на мишките се определят колориметрично, докато нивото на плазмения инсулин се определя чрез ELISA на 15 минути.

Анализ на съдържанието на инсулин в панкреаса, циркулиращи фактори и ядрено-магнитен резонанс

Съдържанието на инсулин в панкреаса се определя от целия панкреас чрез киселинно-етанолова екстракция и инсулин ELISA. Плазмената глюкоза се определя чрез колориметричен комплект за глюкозна оксидаза (Cayman Chemical, Ann Arbor, MI). Плазменият инсулин се определя чрез ELISA (Meso Scale Diagnostics, Rockville, MD). % HbA1c се определя колориметрично от цяла кръв (Crystal Chem, Elk Grove Village, IL). Плазменият холестерол, триглицеридите, AST и ALT се определят с помощта на автоанализатора cobas c111 (Roche, Базел, Швейцария). Чернодробната мазнина се определя с помощта на Bruker minispec mq (Bruker, Billerica, MA). Съставът на тялото се определя с помощта на анализатора Bruker LF90II.

Имунохистохимия и анализ на β-клетъчната маса

За имунохистохимия панкреатите бяха фиксирани, вградени и нарязани на 5-μm участъци. Секции бяха оцветени върху системата BOND RX (Leica Microsystems, Buffalo Grove, IL) със заешки анти-MafA (Bethyl Laboratories, Montgomery, TX) или заешки anti-Ki67 (Abcam, Cambridge, MA), последвано от извличане на антиген, 3,3 ′ -Диаминобензидиново оцветяване и откриване на глюкагон/инсулин, както е описано по-рано (12). Масата на β-клетки и α-клетки се определя количествено от оцветени с инсулин/глюкагон (кафяви/розови) участъци (n ≥ 3), като се използва софтуер HALO (Indica Laboratories, Corrales, NM). Тук инсулин/глюкагон/хематоксилин хромогенно оцветени диапозитиви бяха сканирани и качени в софтуерния пакет HALO. HALO прави разлика между оцветената/неоцветената област и по този начин може да определи количествено площта на панкреаса, заета от инсулин или глюкагон. От тези стойности можем да определим съотношенията на площта на панкреаса към β-клетка или α-клетка (т.е. съответно β-клетъчна маса, α-клетъчна маса).

Количествена електронна микроскопия

Прясно изолирани островчета се фиксират в 0,1 mol/L какодилатен буфер, съдържащ 4% параформалдехид/2% глутаралдехид. Пробите бяха вградени в смола, разрязани и оцветени, както беше описано по-горе (11). Микрографиите са изобразени и количествено определени, както е описано по-рано (12). Зрелите инсулинови гранули и незрелите инсулинови гранули се определят количествено на обща цитоплазмена площ от ≥20 електронни микрографии на група (n ≥ 3 биологични повторения, ≥1,0 ​​mm 2 обща цитоплазмена площ).

Изолация на островчета, стимулирана от глюкоза секреция на инсулин, перифузия и количествена RT-PCR

Статистически анализ

Нормалността на данните се определя от теста D’Agostino и Pearson. Параметричните данни бяха анализирани чрез еднопосочен или двупосочен ANOVA, последван от тест на Tukey. Непараметричните данни бяха анализирани чрез тест на Kruskal-Wallis, последван от тест за множество сравнения на Dunn. За експериментите на островчета (фиг. 3 и 4) данните за отделни кохорти са анализирани поотделно, за да се потвърди, че не съществуват статистически разлики между комбинирани данни за кохорти и данни за отделни кохорти (данните не са показани). Данните са представени като средни стойности ± SD или графики на кутията и мустаците ± минимум/максимум, според случая Всички данни бяха анализирани с помощта на GraphPad Prism 7.02 (GraphPad Software, Сан Диего, Калифорния). Статистическата значимост е определена на P ≤ 0,05.

Резултати

Антидиабетна ефикасност на SGLT-2i в комбинация с GLP-1 или TZD терапии

Възстановяване на експресията на панкреаса MafA и съдържание на β-клетъчен инсулин

Съдържание на панкреатичен инсулин, имунохистохимия на фиксирани панкреати и електронна микроскопия на прясно изолирани панкреатични островчета. A: Съдържание на инсулин в панкреаса (n ≥ 6). B: β-клетъчна маса от двойно оцветени инсулин/глюкагон секции с имунохистохимия (n ≥ 4). C и D: Количествено определяне на зрели и незрели инсулинови гранули от електронни микрографии (n ≥ 3 от ≥10 електронни микрографии). E – K: Представителни електронни микрографии на прясно изолирани островчета от мишки KS db/db, третирани с носител, розиглитазон, дапаглифлозин, лираглутид, розиглитазон/дапаглифлозин, дапаглифлозин/лираглутид и необработени постни мишки C57BLKS/J (n ≥ 3). Скала = 1 μm. L – R: Имунохистохимично оцветяване на инсулин (жълт), MafA (кафяв) и глюкагон (32) от фиксирани панкреати от мишки KS db/db, третирани с носител, розиглитазон, дапаглифлозин, лираглутид, розиглитазон/дапаглифлозин, дапаглифлозин/лираглутид и лираглутид, нетретирани слаби мишки C57BLKS/J (n ≥ 4). * P ≤ 0,05, ** P ≤ 0,01, *** P ≤ 0,001, **** P ≤ 0,0001 спрямо превозно средство. Звездичките над ред показват значимост спрямо посочената група. D, дапаглифлозин; L, лираглутид; R, розиглитазон; V, превозно средство.

Синергично подобрение на β-клетъчната функция

Експресията на ключови гени, свързани със специфична β-клетъчна функция, бяха изследвани от изолирани островчета след 4-седмично лечение. Ins1 нивата на транскрипт са значително увеличени от двете комбинирани животни с приблизително осем пъти (фиг. 4А), докато нивата на транскрипт Ins2 са значително увеличени в островчетата от монотерапия с лираглутид (петкратно) и животни, комбинирани с лираглутид/дапаглифлозин (шест пъти) (фиг. 4В). Нивата на mRNA на Slc2a2 и Gck се повишават при комбинирано третирани животни спрямо контролите на носителя (фиг. 4С и F), както и нивата на Mafa транскрипт, особено розиглитазон/дапаглифлозин (12 пъти) (фиг. 4D), допълващи MafA имунооцветяването ( Фиг. 3). Експресията на Pdx1 също е значително увеличена в островчета от животни, лекувани с монотерапия с лираглутид и комбинирани терапии (фиг. 4Е).

β-клетъчен функционален генен анализ и перифузия на прясно изолирани островчета. A – F: Прясно изолиран остров qRT-PCR за Ins1, Ins2, Slca2a, Mafa, Pdx1 и Gck (n ≥ 4). Експресията на гена се нормализира към домакинския ген Rna18s и се представя като относителна експресия в сравнение с носител. G: Перифузия на прясно изолирани островчета. От 0 до 42 минути островчетата се перифузират с 2,8 mmol/L глюкоза; от 44 до 88 минути, островчетата се перифузират с 16,7 mmol/L глюкоза. В края на перифузията островчетата се лизират и анализират за съдържание на протеин. H и I: AUC на първа фаза (44-56 минути) и втора фаза (58-88 минути) секреция на инсулин (n ≥ 4). * P ≤ 0,05, ** P ≤ 0,01, *** P ≤ 0,001, **** P ≤ 0,0001 спрямо превозно средство. Звездичките над ред показват значимост спрямо посочената група. D, дапаглифлозин; L, лираглутид; R, розиглитазон; RQ, относително количествено определяне; V, превозно средство.

Тъй като загубата на секреция на инсулин от първа фаза е отличителен белег на секреторната дисфункция на β-клетките (16), ние оценихме секреторния отговор на инсулина в островчетата от контролите на носителя, третирани мишки и постните контроли. Веднага след изолирането, островчетата бяха предварително конфузирани с базални 2,8 mmol/L глюкоза KRBH в продължение на 60 минути, последвани от перифузия с 2,8 mmol/L глюкоза KRBH и след това стимулиращи 16,7 mmol/L глюкоза KRBH за оценка на двуфазната секреция на инсулин. Островчета от лекувани с монотерапия животни демонстрират известно възстановяване на секрецията на инсулин от първа фаза и подобрена секреция на инсулин от втора фаза спрямо островчетата за контрол на носителя (Фиг. 4G). Въпреки това, островчета от комбинирани животни показват силна секреция на инсулин от първа фаза и поддържаща секреция на инсулин от втора фаза, дори в сравнение с островчета от животни, лекувани с монотерапия. Островчетата от комбинирано третирани животни предизвикаха значително по-голяма секреция на инсулин от първа фаза (фиг. 4Н) и втора фаза (фиг. 4I) спрямо контролите на носителя, което показва синергично подобрение при възстановяване на функционалния секреторен капацитет на инсулин в сравнение с монотерапията.

Дискусия

Информация за статия

Благодарности. Авторите благодарят на д-р Jotham Austin II и Yimei Chen от Университета на Чикаго за напреднала микроскопия. Авторите биха искали да благодарят и на групата по фармакология in vivo в Gubra ApS.

Двойственост на интересите. Тази работа е финансирана от MedImmune. Б.Б.Б. и М.Л.Б. са предишни служители на MedImmune. C.B., J.C., M.S., W.K., C.R., J.T., C.J.R. и J.S.G. са настоящи служители на MedImmune. B.B.B., M.L.B., G.H. и R.V.G. са настоящи служители на Gubra ApS. Не са докладвани други потенциални конфликти на интереси, свързани с тази статия.

Принос на автора. Б.Б.Б. проектира проучването, написа ръкописа и извърши проучвания върху животни и всички островни работи. C.B., J.C., M.S. и W.K. извършена имунохистохимия. M.L.B. извършена qRT-PCR. Г.Х. и R.V.G. извършени проучвания върху животни. C.R., J.T., C.J.R. и J.S.G. подпомогнат в експерименталния дизайн. Б.Б.Б. е гарант за тази работа и като такъв е имал пълен достъп до всички данни в проучването и поема отговорност за целостта на данните и точността на анализа на данните.

Предварително представяне. Части от това проучване бяха представени на 77-ата научна сесия на Американската диабетна асоциация, Сан Диего, Калифорния, 9–13 юни 2017 г.