Редактиран от Грег Л. Семенца, Медицински факултет на Университета Джон Хопкинс, Балтимор, д-р, и одобрен на 10 август 2018 г. (получено за преглед на 24 май 2018 г.)

производни

Тази статия има поправка. Моля виж:

Вижте свързаното съдържание:

Значимост

Напрежението с кислород играе критична роля в отговора на лъчева терапия (RT). Тук показваме, че хипоксичните тумори могат да бъдат сенсибилизирани към RT чрез насочване към митохондриалното дишане. Идентифицирахме 150-годишното одобрено от FDA лекарство папаверин като инхибитор на митохондриален комплекс I. Еднократна доза от лекарството преди RT намалява хипоксията при моделни тумори и поразително засилва отговора на RT. Добре оксигенираните нормални тъкани не са радиосенсибилизирани. Премахването на инхибиторната активност на фосфодиестераза 10А на папаверин чрез структурна модификация идентифицира потенциално по-безопасно генериране на сложни I-инхибиращи радиосенсибилизатори.

Резюме

Туморната хипоксия намалява ефективността на лъчетерапията чрез ограничаване на биологично ефективната доза. Поради това едно рязко увеличаване на оксигенацията на тумора преди радиационно лечение трябва значително да подобри убиването на туморните клетки след облъчване. Усилията за увеличаване на доставката на кислород до тумора не показват положителни клинични резултати. Тук показваме, че насочването към митохондриалното дишане води до значително намаляване на нуждите на туморните клетки от кислород, което води до повишена оксигенация на тумора и радиационен отговор. Идентифицирахме активност на одобреното от FDA лекарство папаверин като инхибитор на митохондриален комплекс I. Също така предоставяме генетични доказателства, че инхибирането на комплекс I на папаверина е пряко отговорно за повишената оксигенация и засиления радиационен отговор. Освен това, ние описваме производни на папаверин, които имат потенциал да станат клинични радиосенсибилизатори с потенциално по-малко странични ефекти. Важно е, че тази радиосенсибилизираща стратегия няма да сенсибилизира добре оксигенираната нормална тъкан, като по този начин увеличава терапевтичния индекс на лъчетерапията.

Хипоксията е често срещана микросредна характеристика на солидните тумори (1), която съществува, тъй като доставката на кислород е недостатъчна, за да отговори на метаболитните нужди на тумора (2, 3). Лошо оформените туморни кръвоносни съдове затрудняват терапевтично увеличаването на доставката на кислород за намаляване на хипоксията (4). Преди повече от шест десетилетия беше признато, че хипоксията е бариера пред ефективната лъчева терапия (5). Това представлява сериозен клиничен проблем, тъй като повече от 50% от туморите получават лъчева терапия като част от лечението си (6).

Молекулярният кислород е електрофил, който фиксира индуцирано от радиация увреждане на ДНК (7, 8), повишавайки токсичността с 2,5 пъти (9). Поради това намаляването на туморната хипоксия преди лъчетерапията трябва да повиши лъчевата ефикасност, без да увеличава токсичността в добре окислената нормална тъкан. Предишни стратегии за облекчаване на туморната хипоксия са били насочени главно към увеличаване на доставката на кислород в тумора (10, 11). Обаче, ограничената функционалност на туморната васкулатура се оказа основно ограничение за превеждане в клиниките.

Алтернативна стратегия за увеличаване на оксигенацията на тумора е чрез намаляване на туморното търсене на кислород чрез инхибиране на митохондриалното дишане (12). Изчислителните модели прогнозират, че намаляването на скоростта на консумация на кислород (OCR) ще намали хипоксичната фракция по-ефективно, отколкото увеличаването на скоростта на доставяне (13). Въпреки че наскоро за тази цел бяха предложени няколко лекарства (14), техният транслационен потенциал е ограничен от изискванията за усвояване, биологичния полуживот на съединението, токсичността поради странични ефекти или от изискванията за мутации на водача, които ограничават приложимост към специфични подгрупи на ракови заболявания. Оптималното лекарство би имало универсално инхибиране на OCR, бързо усвояване без нужда от протеини-носители, кратък полуживот, добър профил на безопасност и бързо изчистване от пациента.

Резултати

Папаверинът намалява OCR чрез инхибиране на митохондриален комплекс I.

Наскоро беше установено, че папаверинът (PPV) забавя растежа на клетките в среда, съдържаща само галактоза като източник на въглерод (20), което показва инхибиране на митохондриалната функция. Тествахме PPV in vitro в панел от 28 рака и нормални клетъчни линии и установихме, че той може да намали митохондриалната функция във всички клетки, тествани за минути при ниски микромоларни концентрации (фиг. 1А и приложение SI, таблица S1). За да определим неговия механизъм на действие, тествахме PPV в комбинация с установени митохондриални отрови и установихме, че той може дозозависимо да блокира активността на класическия комплекс I инхибитор ротенон (фиг. 1В), което предполага известна конкуренция на двете лекарства. При подобен анализ с други комплексни I инхибитори пиерицидин А или капсаицин не е имало взаимодействие (SI Приложение, Фиг. S1 A и B). Това предполага, че PPV може да се свърже с ротеноновия сайт или евентуално неговото свързване да блокира този сайт, в съгласие с публикувани данни (21). За да потвърдим, че PPV инхибира комплекс I, ние третирахме пермеабилизирани EO771 клетки или с PPV, или с ротенон, последвано от комплекс II субстрат сукцинат, който може да заобиколи инхибирането на комплекс I. Фиг. 1С показва, че сукцинатът е спасил OCR както на третирани с ротенон, така и на PPV клетки, но не и на клетките, третирани с комплексния 3 инхибитор антимицин А, потвърждавайки, че действието на PPV е по-горе от комплекс 2 (фиг. 1С).

Папаверинът намалява OCR чрез инхибиране на митохондриален комплекс I. (A) Представителни данни за морски кончета, показващи намален OCR в клетки EO771. (Б) Анализ на конкуренцията между папаверин и ротенон, инжектирани, както е посочено в клетки EO771. (C) Сукцинатен спасителен тест в проникнали клетки EO771. PPV или ротенон се инжектират самостоятелно или в комбинация с комплекс III инхибитор антимицин А (AntA) по време А; сукцинат (Succ) се инжектира по време B. (D) Анализ на доза-отговор в клетъчна линия A549. (E) Експеримент за измиване на наркотици в клетки A549, намаляване на OCR при 3 h от 10 μM PPV или 1 μM ротенон (магента) и след отстраняване при T-2 h (синьо) или 1 h (черно). Лентите за грешки представляват SD.

За да оценим ефективността на PPV като комплексен I инхибитор, лекувахме клетки A549 с нарастващи дози PPV и ротенон. Анализът на дозата-отговор показва, че IC50 на PPV за OCR е ∼100 × по-висок от този на ротенон (фиг. 1D). Също така сравнихме ефекта на PPV с други лекарства, предложени за употреба като метаболитни радиосенсибилизатори, метформин и atovaquone (SI Приложение, Фиг. S1C). In vitro анализ на морски кончета показва, че докато PPV и atovaquone отнемат 30 минути (фиг. 1А), метформин изисква 24 часа (в mM концентрации), за да достигне пълно инхибиране на митохондриите. Идеалните метаболитни радиосенсибилизатори трябва да имат обратима активност, така че потенциалът за токсичност да бъде ограничен. Интересното е, че митохондриалният ефект на PPV е обратим in vitro в сравнение с потенциално по-токсичните необратими ефекти на ротенон (22) и атовакуон. В експерименти с измиване на лекарства, третирани с PPV клетки се връщат към изходния OCR за по-малко от 1 час, докато третирани с ротенон и атовакуон клетки не показват възстановяване на митохондриалната функция след 3 часа. Това свойство може да обясни отличния профил на безопасност на папаверина (15) (фиг. 1E и приложение SI, фиг. S1D). В подкрепа на неговата безопасност не наблюдаваме клетъчна токсичност в клетки, третирани с PPV нито при нормоксия, нито при хипоксия (SI приложение, фиг. S1 E и F).

Папаверинът намалява туморната хипоксия и подобрява реакцията на лъчева терапия.

Папаверинът радиосенсибилизира чрез инхибиране на комплекс I. (А) Western blot на експресия на NDI1 в митохондриални фракции на родителски A549 и NDUFV1 KO клетки. (B) Представителна жизнеспособност на трипан синьо (n = 3) на клетки, отглеждани в среда, съдържаща само галактоза (T = 96 h). Стойностите представляват средни жизнеспособни клетки ± SD. (C) Анализ на морски кончета на отговора на родителските клетки A549 и NDUFV1 KO ± NDI1 към 10 μM папаверин или 1 μM ротенон. Стойностите са средни ± SD. (D) Количествено определяне на оцветяването с пимонидазол в NDUFV1 KO NDI1 флангови тумори, третирани с 2 mg/kg PPV или носител (n = 3). Стойността е средна стойност на положителни за пимонидазол клетки от 20 изображения на тумор ± SEM. Стойността на Р се изчислява с t тест. (E) Количествено определяне на забавяне на растежа на тумора на хетеротопни NDUFV1 KO NDI1 флангови ксенотрансплантати, получаващи или 8 Gy XRT (магента), или 2 mg/kg PPV 35 минути преди 8 Gy XRT (синьо) (n = 4). Кривите представляват средни обеми на тумора ± SEM. Стойностите на Р бяха изчислени спрямо XRT с t тест. n.s., без значение.

Папаверинът може да бъде реинженериран, за да премахне PDE-инхибиращата активност.

Измервания на частично кислородно налягане in vivo.

Оцветяване с пимонидазол.

Адуктите на пимонидазол се визуализират в хипоксични области в рамките на хистологични раздели на туморни тъкани (39). Мишки, носещи флангови ксенотрансплантати EO771 и A549, бяха третирани с 2 mg/kg PPV или физиологичен разтвор и 30 минути по-късно 60 mg/kg пимонидазол i.p. и тумори бяха събрани на 90 минути. Замразените срезове бяха оцветени с анти-пимонидазол заешко антитяло и анти-заек Alexa Fluor 488. Хипоксичната фракция на всеки тумор беше количествено определена чрез праг на сигнал при 50% от максималния сигнал на контролните секции. Площта, покрита с положителни за пимонидазол клетки, беше оценена от 20 изображения на животно и осреднена.

Кинетика на растежа на тумора.

2 × 10 6 EO771 или 5 × 10 6 A549 клетки се инжектират s.c. във фланговете на 6-седмични женски имунокомпетентни C57/B6 (EO771) или имунокомпрометирани мишки nu/nu (A549). За изчисляване на обемите на тумора са използвани измервания на калипер с противоположен диаметър. При достигане на 150 mm 3 туморите се визуализират чрез CT с конусен лъч и плановете за лечение се изчисляват с помощта на софтуера SARRP. Рентгеновите лъчи бяха доставени с един лъч, доставящ 5 Gy, използвайки радиационната платформа за малки животни (SARRP; Xstrahl). Обемите на тумора се измерват, докато обемът след лечението се увеличи трикратно.

Анализ на чревна крипта.

Мишки от див тип C57/B6 получиха коремна доза от 7,5 Gy XRT, доставена с помощта на SARRP. Разчленените тънки черва бяха фиксирани с 10% естествено буфериран формалин (NBF), преди да бъдат вградени в парафин. Anti-Ki67 антитяло (Thermo Scientific RM-9106-S) е открито от Vector Laboratories козе анти-заешко (DAB хромаген).

Благодарности

Благодарим на Кайл Портър за неговите статистически данни и Navdeep Chandel за NDI1 експресионния плазмид. Финансирането беше осигурено от грантове NIH P01CA016776 и R01CA163581.

Бележки под линия

↵ 1 Настоящ адрес: Институт за разработване на нови лекарства, Китайски медицински университет, Тайчунг 404, Тайван.

Принос на автора: E.G., Q.-T.L., A.C.K., A.J.G., S.-C.C. и N.C.D. проектирани изследвания; M.B., X.H., S.V., S.S., J.W. и I.P. извършени изследвания; X.H. и B.Y. допринесе нови реактиви/аналитични инструменти; M.B., S.V., J.W., E.G., Q.-T.L., A.C.K., A.J.G., S.-C.C., I.P. и N.C.D. анализирани данни; и М.Б. и N.C.D. написа вестника.

Авторите не декларират конфликт на интереси.