Принадлежности INRA, CRNH-IdF, UMR914 Хранителна физиология и поглъщащо поведение, Париж, Франция, AgroParisTech, CRNH-IdF, UMR914 Хранителна физиология и поглъщащо поведение, Париж, Франция

природата

Принадлежности INRA, CRNH-IdF, UMR914 Хранителна физиология и поглъщащо поведение, Париж, Франция, AgroParisTech, CRNH-IdF, UMR914 Хранителна физиология и поглъщащо поведение, Париж, Франция

Принадлежности INRA, CRNH-IdF, UMR914 Хранителна физиология и поглъщащо поведение, Париж, Франция, AgroParisTech, CRNH-IdF, UMR914 Хранителна физиология и поглъщащо поведение, Париж, Франция

Принадлежности INRA, CRNH-IdF, UMR914 Хранителна физиология и поглъщащо поведение, Париж, Франция, AgroParisTech, CRNH-IdF, UMR914 Хранителна физиология и поглъщащо поведение, Париж, Франция

Принадлежности INRA, CRNH-IdF, UMR914 Хранителна физиология и поглъщащо поведение, Париж, Франция, AgroParisTech, CRNH-IdF, UMR914 Хранителна физиология и поглъщащо поведение, Париж, Франция

Принадлежности INRA, CRNH-IdF, UMR914 Хранителна физиология и поглъщащо поведение, Париж, Франция, AgroParisTech, CRNH-IdF, UMR914 Хранителна физиология и поглъщащо поведение, Париж, Франция

  • Натали Пупен,
  • Сесиле Бос,
  • Франсоа Мариоти,
  • Жан-Франсоа Хюно,
  • Даниел Томе,
  • Hélène Fouillet

Фигури

Резюме

Цитат: Poupin N, Bos C, Mariotti F, Huneau J-F, Tomé D, Fouillet H (2011) Природата на диетичния протеин въздейства върху факторите за дискриминация 15 N на тъкани към диета при лабораторни плъхове. PLoS ONE 6 (11): e28046. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0028046

Редактор: Стефан Блан, Институт по плудисциплина Хуберт Кюриен, Франция

Получено: 8 юни 2011 г .; Прието: 31 октомври 2011 г .; Публикувано: 22 ноември 2011 г.

Финансиране: Натали Пупен е подкрепена от докторска стипендия от френското министерство за научни изследвания. Финансистите не са играли роля в дизайна на проучването, събирането и анализа на данни, решението за публикуване или подготовката на ръкописа.

Конкуриращи се интереси: Авторите са прочели политиката на списанието и имат следните конфликти: Един от авторите (Даниел Томе) е член на академичната редакционна колегия PLoS ONE.

Въведение

Резултати

Състав на тялото, тъканна маса и съдържание на азот

Двете експериментални групи, получаващи диета с млечен протеин (MP) или соев протеин (SP), имат сходни темпове на растеж и тъканни маси (Таблица 1). Съдържанието на азот във протеиновите (PF) и непротеиновите (nPF) фракции на тъканите в края на 3-седмичния експериментален период са сходни между групите (Таблица S1), с изключение на по-ниско съдържание на азот в nPF на целия мускул маса (-37%) при плъхове, хранени със SP в сравнение с MP. Нито едно от общото съдържание на азот в тъканите не е повлияно от диетата (Таблица S1). Не са открити разлики в съдържанието на азот в плазмените протеини и урея между групите (Таблица S1).

Вариации в Δ 15 N между тъканите и протеините

Δ 15 N от (A) тъканни протеинови фракции (δ 15 Nprotein фракция − δ 15 Ndiet), (B) тъканни протеинови фракции (δ 15 N non-протеинова фракция − δ 15 Ndiet) и (C) плазмен карбамид (δ 15 Nplasma карбамид - δ 15 Ndiet), на плъхове, хранени с диетата MP (черни ленти) и SP (сиви ленти). Стойностите са средни стойности ± SD. * Ефект на хранителния източник на протеин в дадена тъкан (Post hoc тестове с корекции на Tukey, P Таблица 2. Вариации в стойностите на азотната изотопна дискриминация между различните тъкани и между азотните фракции в тъканите за плъхове, хранени с млечен протеин или соев протеин -диета за 3 седмици.

Ефект на диетата върху Δ 15 N в тъканите и протеините

Δ 15 N също варира спрямо източника на протеин. На тъканно ниво черният дроб, бъбреците и дебелото черво са по-обогатени с 15 N при плъхове, хранени с диета SP, отколкото при плъхове, хранени с MP диета, което води до по-висок общ висцерален Δ 15 N (3,53 3. ± 0,14 2. и 2,58 ‰ ± 0,11 ‰ съответно със SP и MP, таблица 2). На ниво протеин, Δ 15 N стойности също са по-високи при SP от диетата на MP в PF на всички тъкани с изключение на лигавицата SI (фиг. 1А). Тези разлики между двете диети варират и между тъканите. При протеините на дебелото черво, стойностите на Δ 15 N са с ∼160% по-високи в групата с SP, отколкото в групата с МР (съответно 3,52 ‰ и 1,35 ‰), ∼60% по-високи при бъбречните протеини (съответно 2,75 ‰ и 1,73 ‰) и стомашни протеини (съответно 3,39 ‰ и 2,05 ‰), ∼40% по-високи в чернодробните съставни протеини (съответно 4,14 ‰ и 2,98 ‰) и ∼20% по-високи в изнесените от черния дроб плазмени протеини (съответно 4,61 ‰ и 3,81 ‰).

Вариации в Δ 15 N между азотните фракции в плазмата и тъканите

Освен това, стойностите на Δ 15 N се различават между азотните фракции в плазмата (PF срещу урея), както и в тъканите (PF срещу nPF). Каквато и да е диетата, плазмената урея е изчерпана с 15 N спрямо диетата и спрямо PF на плазмата, без диетичен ефект върху Δ 15 N стойностите на плазмената урея (-1,36 ± 1,66 ‰ и -1,61 ± 1,22 ‰ в MP и SP групи, съответно). Плазмената урея също е с 15 N-изчерпване спрямо nPF на черния дроб, неговия предшественик (фиг. 1В, С). В тъканите PF винаги се обогатява с 15 N спрямо диетите (фиг. 1А), докато nPF има или по-високи, подобни или по-ниски 15 N изобилие в сравнение с диетата в зависимост както от тъканите, така и от диетата (фиг. 1В). В тъканите PF обикновено се обогатява с 15 N спрямо nPF (Таблица 2), с изключение на това, че в някои тъкани няма разлика между фракциите (а именно, черен дроб както за MP, така и за SP групи и SI лигавица само за SP група) . Разликите в изобилието от 15 N между PF и nPF варираха от тъкан до тъкан и между диети (Таблица 2): те бяха по-високи за диетата SP, отколкото за диетата MP в дебелото черво, бъбреците и стомаха, докато те бяха по-ниски в плазмата и лигавицата на SI.

Дискусия

В това проучване ние изследвахме специфичното въздействие на качеството на хранителните протеини (мляко срещу соев протеин) върху азотните изотопни сигнатури в голям набор от тъкани и басейни на плъхове при контролирани условия, т.е. при подобни условия на количествен прием на протеин, растеж и състав на тялото между групите. Стойностите на дискриминация (Δ 15 N) са изчислени в басейните с бързо преобръщане (висцерални тъкани и плазма), които са или са близо до изотопното им равновесие с диетата в края на 3-седмичния експериментален период. Показахме, че Δ 15 N се различават значително между басейните и са ясно засегнати от естеството на хранителния протеин в повечето басейни. Наблюдаваните разлики Δ 15 N между диетите вероятно са резултат от фини модулации на метаболизма на протеините и аминокиселините, предизвикани от разликите в аминокиселинния състав и качеството между млечните и соевите протеини.

Вариации в различителните стойности между азотните фракции в тъканите и плазмата

Противно на екологичните проучвания, които обикновено отчитат Δ 15 N стойности за плазма или тъкани, анализирани като цяло, ние тук измерваме специално естественото 15 N изобилие в различни азотни фракции на тъканите (PF и nPF) и плазмата (PF, nPF и урея) ).

Първо, нашите резултати от Δ 15 N стойности за тъканните протеинови фракции, които представляват основната част от тъканния азот, потвърждават, че тъканите, и по-точно тъканните протеини, обикновено са обогатени с 15 N спрямо диетата, с диапазон от Δ 15 N стойности (от 1,4 1.4 до 4,6 ‰) в съответствие с литературните стойности, съобщени за цели тъкани при гризачи [1], [4], [8], [30] - [36]. Също така, ние показахме, че за дадена тъкан Δ 15 N стойности варират между нейните азотни фракции. PF обикновено са значително обогатени с 15 N в сравнение с nPF, което може да се обясни с изотопен ефект по един или няколко от метаболитните пътища в тъканите, като метаболитни взаимообмен на аминокиселини, протеинов синтез или разграждане на протеини.

Вариации в различителните стойности между телесните протеини

Наблюдавахме значителни разлики в Δ 15 N стойности между телесните протеини. Например, какъвто и да е хранителният източник на протеини, плазмените протеини (които произхождат най-вече от синтеза в черния дроб) са имали най-високо 15 N изобилие в сравнение с всички останали проби, включително чернодробните съставни протеини, а чернодробните протеини са имали по-високо 15 N изобилие от останалите взети проби. Последователни наблюдения на по-високи Δ 15 N стойности в плазмата от черния дроб [5], [40] и в черния дроб от бъбреците [4], [35] вече са докладвани в литературата.

Вариации в стойностите на дискриминация в телесните протеини според източника на хранителен протеин

Диетичният протеинов източник силно повлиява азотната изотопна дискриминация между телесните протеини и диетата, с по-високи Δ 15 N при плъхове, хранени със соя, отколкото млечни протеини за всички докладвани протеини, с изключение на този на лигавицата SI. По-високи стойности на Δ 15 N вече са докладвани в черния дроб на плъхове, хранени с диети на растителна спрямо животински протеин [1], [8]. По-конкретно, по-високи стойности на Δ 15 N се наблюдават в черния дроб [8] и в плазмените протеини и протеините на йеюнума [38] на плъхове, хранени със соя срещу диети на основата на млечен протеин. Тук показваме, че този ефект е обща характеристика, доколкото той е последователен за всички пробни висцерални пулове протеини, с изключение на тънките черва. Амплитудата на Δ 15 N разлики между диетите варира между тъканите, което предполага, че протеиновият метаболизъм на тъканите може да бъде диференцирано повлиян от хранителния протеинов източник.

Материали и методи

Декларация за етика

Експериментите бяха проведени в съответствие с препоръките в Ръководството на NIH за грижа и използване на лабораторни животни. Протоколът е одобрен от Етичния комитет за експерименти с животни (COMETHEA) на центъра Jouy-en-Josas INRA и AgroParisTech (Номер на одобрение 11/015).

Животни и диети

Мъжки плъхове Wistar (n = 18), първоначално тежащи 191 g, са закупени от Harlan (Франция) и са настанени в регулирана температура (22 ± 2 ° C) на 12-часов цикъл светлина-тъмнина (тъмен период от 9: От 00 до 21:00). Преди началото на експеримента, плъховете бяха адаптирани към лабораторните условия за една седмица със свободен достъп до търговска лабораторна диета (δ 15 N≈4 ‰). След това животните бяха разделени на случаен принцип в две групи и назначени да получат една от двете експериментални диети. Първоначалните телесни тегла бяха сходни за двете групи.

Двете диети бяха изоенергийни, идентични по своя хранителен състав (20% от енергията като протеин, 30% като липиди и 50% като въглехидрати) и отговаряха на изискванията за растеж. Те се различават по своя източник на протеин, или млечен протеин (MP, n = 9), или соев протеин (SP, n = 9) (Таблица 3). Диетите бяха изготвени от UPAE (Unité de Préparation des Régimes Expérimentaux, Френски национален институт по агрономически изследвания, INRA, Jouy en Josas, Франция).

Експериментален протокол и процедури за вземане на проби

След периода на адаптация от 1 седмица, плъховете бяха хранени с една от двете експериментални диети за 3 седмици. Плъховете получиха безплатен достъп до храна от 9:00 до 19:00 (през тъмния период) и имаха свободен достъп до вода през целия ден. Теглото на тялото се измерва два пъти седмично. В края на седмица # 3 (ден 21 или 22), всички плъхове бяха убити след нощно гладуване.

Плъховете бяха анестезирани с интраперитонеална инжекция на натриев пентобарбитал (100 mg/kg телесно тегло, доза, която е твърде малка, за да повлияе значително на измерените изотопни сигнатури въз основа на начина на приложение на този анестетик и на кинетиката на разпределение на барбитуратите в тъканите и плазма на плъхове [49]). Коремът беше отворен и приблизително 5 ml кръв бързо бяха изтеглени от кухата вена. След това животните бяха убити чрез разкъсване на куха вена и аорта. Черният дроб, тънките черва (SI), стомаха, дебелото черво, бъбреците, мускулите на гастрокнемиума и солеуса бяха бързо разчленени, изплакнати, претеглени и щракащи замразени в течен азот. SI беше остърган, за да се събере лигавицата, която беше замразена отделно. Взети са проби от коса и кожа. Всички проби се съхраняват при -20 ° C до анализ.

Подготовка на пробите

Във всяка тъкан бе изолирана протеиновата фракция (PF) и непротеиновата фракция (nPF) за отделно определяне на съдържанието на азот и изотопните съотношения във всяка фракция. Замразените тъкани се пулверизират с хаванче, охладено в течен азот и утаено чрез добавяне на 700 µL 5-сулфосалицилова киселина (10%) на 100 mg тъкан. След центрофугиране (2 500 g, 4 ° С, 15 минути), супернатантата се екстрахира и утайката се изплаква два пъти със 700 uL 5-сулфосалицилова киселина (10%). След това разтворимата фракция (т.е. nPF, съдържаща свободните аминокиселини) и неразтворимата фракция (т.е. PF, съдържаща свързаните с протеините аминокиселини) бяха лиофилизирани.

В плазмата различните азотни фракции (PF, nPF и урея) също бяха разделени. PF се изолира чрез утаяване със сулфосалицилова киселина (200 uL, 1 g/ml). След 1-часово съхранение при 4 ° С и центрофугиране (2000 g, 4 ° C, 20 минути), утайката се изплаква с 1 ml сулфосалицилова киселина (1 g/ml), центрофугира се отново и се замразява. Екстрахираната разтворима фракция, съдържаща nPF и урея, беше неутрализирана и прехвърлена върху 0,5 ml катионообменна смола (Dowex AG50X8, Biorad, Marnes-la-coquette, Франция) за свързване на амония, освободен от хидролиза на карбамид (8 µL уреаза за 2 часа при 30 ° С). Натоварената с амоний смола се измива и се държи при 4 ° С до анализ, докато изчерпаният с урея супернатант, съдържащ аминокиселини и пептиди, се събира и филтрира, за да се елиминират пептиди, по-големи от 3 kDa (Amicon Ultra-4, Ultracel 3k, Millipore, Carrigtwohill, Ирландия) и изолирайте nPF. Преди изотопно определяне, полученият от урея амоняк се елуира от смолите чрез добавяне на KHSO4 (2.5 mol/L).

Елементен анализ и изотопни определяния

Естествените стабилни изотопни съотношения на азот се определят в плазмената урея и в PF и nPF на тъканите и плазмата, като се използва масспектрометър с изотопно съотношение (Isoprime, VG Instruments, Manchester, UK), свързан с елементарен анализатор (EA 3000, Eurovector, Италия ). Във всеки цикъл бяха включени стандарти, за да се коригират възможните вариации в суровите стойности, измерени от масспектрометъра. Резултатите бяха изразени с помощта на делта нотация съгласно следното уравнение: където Rsample и Rstandard са азотното изотопно съотношение на по-тежкия изотоп към по-лекия изотоп (15 N/14 N) за анализираната проба и международно дефинирания стандарт (атмосферен N2, Rstandard = 0,0036765), съответно и δ е делтата в части на 1000 или на мелница (‰) спрямо стандарта.

Общото съдържание на азот в тъканите PF и nPF и в плазмата PF се определя с помощта на елементарен анализатор (EA 3000, Eurovector, Италия), с атропин като стандарт. Концентрациите на карбамид в плазмата се определят с търговски комплект, използващ ензимен метод (комплект карбамид S-1000, Biomerieux, Craponne, Франция).

Изчисления и статистика

Пробите от тъкани бяха претеглени преди и след лиофилизиране, за да се оцени сухото вещество в тъканите. Съдържанието на азот във всяка пробна тъканна фракция (PF или nPF) се изчислява въз основа на следното уравнение: където% N и% DM (%) са съответно процентите на азот и сухо вещество, измерени в пробата, и m (g ) е общата маса на тъканта. Общите мускулни и кожни маси не са измерени, но са оценени съответно на 45% [50] и 15% [51] от общата телесна маса.

Съдържанието на азот в плазмените PF и nPF се изчислява като продукт на концентрацията на азот във фракцията и плазмения обем, оценен като 3,5% от телесната маса [52]. Концентрацията на азот в плазмения nPF се изчислява, като се използват стойности на аминоацидемия, получени от нашата група при подобни условия (3,1 mmol/L, т.е. 4,4 mmol/L азотни еквиваленти) [53]. Съдържанието на азот в плазмения карбамиден басейн (Nurea, mmol) се оценява въз основа на плазмената концентрация на карбамид (Curea, mmol/L карбамиден азот), неговия обем на разпределение (т.е. обща телесна вода, оценена на 62,3% от телесна маса, BM, Kg) [54] и корекционен фактор от 92%, който представлява водното съдържание в кръвта: [55].

Изотопната азотна дискриминация между басейн и диета е описана като разликата в δ 15 N, използвайки нотацията Δ, където Δ 15 N = δ 15 Npool − δ 15 N диета (Δ 15 N> 0 показва по-голямо изобилие в 15 N в басейн спрямо диетата). Тъй като диетите MP и SP имат различни естествени изотопни съотношения (δ 15 Ndiet са 7,7 7 за MP и 1,7 ‰ за SP), Δ 15 N се използва за сравняване на изотопния състав на тъканите на животни, хранени с различни диети.

Стойностите на Δ 15 N бяха изчислени в басейните за бързо обръщане, които вероятно са достигнали или почти са достигнали изотопното си равновесие с диетата в края на 3-седмичния експериментален период (плазмен карбамид и всеки от PF и nPF на висцералните тъкани и плазма). За всяка висцерална тъкан и плазма се изчислява обща стойност на Δ 15 N като претеглената средна стойност на изотопните състави на различните му азотни фракции, като, където mi е количеството азот във фракцията i, а Δi е изотопната дискриминация между фракция i и диетата. По същия начин, сборната висцерална Δ 15 N е изчислена като среднопретеглената стойност на изотопните състави на PF и nPF на черния дроб, лигавицата на SI, стомаха, бъбреците и дебелото черво.

Резултатите са изразени като средни стойности ± SD. Ефектите от диетата (MP срещу SP) и тъканите и тяхното взаимодействие бяха анализирани чрез двупосочен дисперсионен анализ (Proc GLM, SAS 9.1, SAS Institute, Cary, NC, USA). Тестовете post hoc с корекции на Tukey или Bonferroni са използвани за множество сравнения между тъкани и диетични групи (MP срещу SP). Стойностите на Р <0,05 се считат за значими.

подкрепяща информация

Таблица S1.

Азотен състав на тъканите и плазмата на плъхове, хранени с млечен протеин или диета на основата на соев протеин в продължение на 3 седмици.