Braz J Med Biol Res, декември 2006 г., том 39 (12) 1581-1586 (кратко съобщение)

лишени

Производството на имуноглобулин е нарушено при мишки, лишени от протеини и може да бъде възстановено чрез хранителни добавки с протеини

J.F.Amaral 1, D.A. Фошети 1, Ф. А. Асис 1, Дж. Menezes 2, N.M.Vaz 1 и A.M.C. Фария 1

1 Departamento de Bioquímica e Imunologia, Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal de Minas Gerais, Belo Horizonte, MG, Бразилия
2 Departamento de Imunologia, Instituto de Ciências Biomédicas, Университет на Сао Пауло, Сао Пауло, SP, Бразилия

Ключови думи: Хранителни протеини, имуноглобулини, узряване, лигавица

Повечето контакти с чужди антигени възникват в лигавицата на червата, като тези антигени са представени от хранителни протеини и автохтонната микробиота (1). Наличието на голяма свързана с червата лимфоидна тъкан (GALT) обикновено се дължи на стимулация от антигени от микробиотата, тъй като тази тъкан е драстично намалена при животни без микроби. Без микробни мишки носят по-малки петна на Пайер, редки клетки на ламина проприа и половината от нормалния брой интраепителни лимфоцити (2). Нивата на секреторния IgA, както и на серумните IgA и IgG, но не и IgM, също са намалени при тези животни (3). Имунологичните промени, наблюдавани при мишки без антиген, които са лишени от микробна и диетична стимулация, са по-тежки (4-7), което предполага, че хранителните протеини също участват в имунологичното развитие.

По-рано показахме, че хранителните протеини сами по себе си играят ключова роля за пълното узряване на имунната система. C57BL/6 мишки, отбити от диета, при която непокътнатите протеини се заменят с еквивалентни количества аминокиселини (Aa диета), представят незряла имунна система, измерена по няколко параметъра. Възрастни (на възраст 8-12 седмици) Aa-хранени мишки показват слабо развит GALT с по-малък брой интраепителни лимфоцити и клетки на lamina propria и нарушено производство на секреторен IgA в сравнение с контролните мишки. Те също така показват намаляване на размера на пластирите на Peyer и техните зародишни центрове в сравнение с мишки, хранени с контролна диета, съдържаща казеин. В допълнение, нивата на серумни IgG и IgA, но не и IgM, се намаляват при Aa-хранени мишки. Производството на цитокини in vitro от Т клетки от няколко лимфоидни органа на тези мишки показва преобладаващ Th2 профил с висока концентрация на IL-10 и IL-4 и ниска концентрация на интерферон гама. По този начин, във всички изследвани имунологични параметри тези възрастни животни приличат на сучещи мишки (8), което предполага, че стимулацията от хранителни протеини след отбиването играе критична роля за узряването на имунната система (9). Мишките, хранени с елементарна диета след отбиването, имат подобни дефекти в имунната функция, когато станат възрастни (10).

От предишните ни данни възникнаха два важни въпроса: а) дали увреждането на имунната функция, свързано с лишаване от хранителен протеин, е било обратимо при възрастни животни и, ако е така, б) коя е минималната концентрация на хранителен протеин, необходима за насърчаване на възстановяването на имунологичните функция. В настоящото проучване разгледахме тези два въпроса. Първо, ние изследвахме ефектите от период от 1 до 30 дни от въвеждането на казеин-съдържаща диета (контролна диета) на възрастни мишки, които са били хранени с диета без протеини (Aa диета) от отбиването. След това оценихме влиянието на различни количества диетични протеини върху възстановяването на имунната функция при възрастни мишки, хранени с Аа.

За да изследваме имунологичното въздействие на въвеждането на диетични протеини на възрастни мишки, хранени с Аа, първо отгледахме мишки C57BL/6 на диета Аа от отбиване (на възраст 3 седмици) до зряла възраст (възраст 8 седмици). Самородните женски мишки C57BL/6, използвани в настоящото проучване, са отглеждани и отглеждани при стандартни условия в нашето животновъдно съоръжение. Всички експериментални протоколи бяха одобрени от Етичния комитет за изследване на животните на UFMG. Контролната диета съдържа 15% казеин като източник на протеин и е наречена Cas диета. Експерименталните диети (Rhoster Indústria e Comércio Ltda., São Paulo, SP, Бразилия) бяха изокалорични и идентични по отношение на всички други хранителни вещества, съгласно указанията от 1993 г. на AIN-93G (Американски институт по хранене) (11). Диета (в твърда форма като гранули) и чешмяна вода се дават ad libitum на всички групи и мишките се поддържат при стандартни условия на отворена клетка по време на експериментите.

Тъй като мишките, хранени с Aa, имат типично намаляване на серумните нива на IgG и IgA, както и на секреторните нива на IgA (9), тези параметри са избрани за оценка на имунологичното развитие на мишки при различни режими на хранене. Мишките бяха обезкървени под анестезия от аксиларния сплит и серумите бяха получени след съсирване и центрофугиране. Секреторният IgA беше измерен в чревната промивна течност, събрана след изолиране на тънките черва на отделни мишки. Нивата на антителата се измерват чрез стандартен ELISA за улавяне. Плаките бяха покрити с кози антимиши Ig (Southern Biotechnology Association, Inc., Birmingham, AL, USA) и серумни имуноглобулинови изотипи бяха открити с помощта на белязани с пероксидаза плъхове антимиши Ig, IgG, IgM или IgA (Sigma, St. Луис, Мисури, САЩ). Реакцията се отчита при 450 nm, като се използва ELISA четец (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Концентрацията на имуноглобулин се определя, като се използва стандартна крива, получена с пречистени Igs от всеки изотип (Southern Biotechnology Association, Inc.). Данните се отчитат като средни стойности ± SEM и значителни разлики между групите се определят от t-теста на Student.

Нивата на имуноглобулин бяха оценени 4 седмици след въвеждането на контролна диета, съдържаща казеин (Cas диета) на 8-седмични мишки, хранени с Аа. Локалната имунна функция, определена от нивата на секреторен IgA, както е показано на фигура 1, е намалена при Aa-хранени мишки в сравнение с Cas-хранени мишки. Въвеждането на казеин-съдържаща диета обаче доведе до прогресивно възстановяване на секреторната концентрация на IgA в чревната слуз (Фигура 1А), която достигна нормални стойности след 72 часа. За да се изследва дали въвеждането на диетични протеини има роля в системната имунна функция, сравнихме серумните нива на имуноглобулин (общ Ig, IgG, IgM и IgA) на мишки, хранени изключително с диета Аа, с тези на мишки, хранени с Аа, които получиха диетата Cas за 4 седмици. Както е показано на Фигура 1В-Е, Aa-хранени мишки имат намалени нива на серумни имуноглобулини в сравнение с Cas-хранени мишки. Когато мишките, хранени с Aa, бяха въведени в диета, съдържаща казеин, те представиха постепенно възстановяване на нивата на серумен имуноглобулин. Нормалните серумни концентрации на имуноглобулини от всички изотипове (с изключение на общия Ig) са достигнати след 72 часа контролна консумация на диета.

За да определим концентрацията на диетичен протеин, която е необходима за насърчаване на това възстановяване на нивата на имуноглобулин, сравнихме концентрацията на серумен IgA и други серумни имуноглобулини при 12-седмични мишки, хранени изключително с Aa-диета (Aa мишки) с концентрацията на имуноглобулини при 12-седмични мишки, хранени с Аа, които са били въведени в диети, съдържащи нарастващи количества казеин (0,5, 2, 5, 10 и 15%) на 8-седмична възраст. За да достигнем до 15% източник на протеин във всяка диета, добавихме допълнителни количества от сместа Аа, така че всички тестови диети да съдържат известна комбинация от казеинови аминокиселини и непокътнат казеин. Както е показано на Фигура 2А, Aa-хранени мишки са имали намалена концентрация на серумен IgA в сравнение с контролните 15% мишки, хранени с Cas. Когато 5% казеин беше въведен в диетата им, мишките, хранени с Аа, показаха възстановяване на нивата на секреторния IgA. За да се възстановят нормалните серумни нива на общия Ig и на IgA, е необходима диета, съдържаща поне 10% казеин (Фигура 2В и D). Серумните IgG и IgM се връщат към нормалните нива при мишки, които са били хранени с диета, съдържаща 5% казеин (Фигура 2С и Е). Любопитното е, че при тези експерименти нивата на IgM също са намалени при Aa-хранени мишки, въпреки че не наблюдаваме намаляване на серумния IgM в предишното ни проучване (9).

[Вижте по-голяма версия на това изображение (96 K JPG файл)]

Фигура 2. Възстановяването на производството на имуноглобулин зависи от концентрацията на хранителен протеин. Белите ленти съответстват на животни, хранени с 15% -казеинова (Cas) диета. Сивите ленти показват животни, хранени с 15% аминокиселинна (Aa) диета. Излюпените ленти показват мишки, които са получили тестови диети, съдържащи променливи комбинации от казеин и аминокиселини, за да достигнат 15% от общия протеин. Чревна промивна течност и серум се събират за оценка на имуноглобулина. Секреторните IgA (sIgA, A) и серумните имуноглобулини, общите Ig (B), IgA (C), IgG (D) и IgM (E) бяха измерени чрез улавяне на ELISA. Данните се отчитат като средна стойност ± SD за 4-5 мишки на група и са представителни за резултатите от два отделни експеримента. * P t-тест).

[Вижте по-голяма версия на това изображение (88 K JPG файл)]

1. Brandtzaeg P. Развитие и основни механизми на човешкия имунен имунитет. Nutr Rev 1998; 56: S5-S18. [Връзки]

2. Bandeira A, Mota-Santos T, Itohara S, Degermann S, Heusser C, Tonegawa S, et al. Локализацията на гама/делта Т клетки в чревния епител е независима от нормалната микробна колонизация. J Exp Med 1990; 172: 239-244. [Връзки]

3. Востман Б. Без микроби и гнотобиотични животински модели. В: Melby EC Jr, Altman NH (редактор), Наръчник по лабораторни животински науки. Кливланд: CRC Press; 1996 г. [Връзки]

4. Hashimoto K, Handa H, Umehara K, Sasaki S. Мишки без зародиши, отглеждани на диета без антиген. Lab Anim Sci 1978; 28: 38-45. [Връзки]

5. Haury M, Sundblad A, Grandien A, Barreau C, Coutinho A, Nobrega A. Репертоарът на серумния IgM при нормални мишки е до голяма степен независим от външния антигенен контакт. Eur J Immunol 1997; 27: 1557-1563. [Връзки]

6. Hooijkaas H, Benner R, Pleasants JR, Wostmann BS. Изотипове и специфичности на имуноглобулини, произведени от мишки без микроби, хранени с химически дефинирана ултрафилтрирана диета без антиген. Eur J Immunol 1984; 14: 1127-1130. [Връзки]

7. Pereira P, Forni L, Larsson EL, Cooper M, Heusser C, Coutinho A. Автономно активиране на В и Т клетки при мишки без антиген. Eur J Immunol 1986; 16: 685-688. [Връзки]

8. Benveniste J, Lespinats G, Adam C, Salomon JC. Имуноглобулини при непокътнати, имунизирани и замърсени аксенови мишки: изследване на серумен IgA. J Immunol 1971; 107: 1647-1655. [Връзки]

9. Menezes JS, Mucida D, Cara DC, Alvarez-Leite JI, Russo M, Vaz NM, et al. Стимулирането с хранителни протеини играе критична роля за узряването на имунната система. Int Immunol 2003; 15: 447-455. [Връзки]

10. Menezes JS, Andrade MC, Senra B, Rodrigues VS, Vaz NM, Faria AM. Имунологичните дейности се модулират чрез ентерално приложение на елементарна диета при мишки. Clin Nutr 2006; 25: 643-652. [Връзки]

11. Reeves PG, Nielsen FH, Fahey GC Jr. AIN-93 пречистени диети за лабораторни гризачи: окончателен доклад на специалната комисия на Американския институт по хранене относно преформулирането на диетата за гризачи AIN-76A. J Nutr 1993; 123: 1939-1951. [Връзки]

12. Cebra JJ. Влияние на микробиотата върху развитието на чревната имунна система. Am J Clin Nutr 1999; 69: 1046S-1051S. [Връзки]

13. Чандра РК. Хранителна регулация на имунните функции. Форум Nutr 2003; 56: 147-148. [Връзки]

Благодарности

Бихме искали да благодарим на Илда Марсал де Соуза за отлични грижи за нашето животновъдно съоръжение.

Кореспонденция и бележки под линия

Адрес за кореспонденция: A.M.C. Faria, Departamento de Bioquímica e Imunologia, ICB, UFMG, Av. Антонио Карлос, 6627, 31270-901 Бело Оризонти, MG, Бразилия. Факс: + 55-31-3499-2640. Имейл: [email protected]

Изследвания, подкрепени от FAPEMIG и CNPq. J.F.Amaral и D.A. Фошети са получатели на стипендии съответно от CAPES и FAPEMIG. Н. М. Ваз и А. М. К. Faria са получатели на стипендии от CNPq. Публикация, поддържана от FAPESP. Получено на 30 януари 2006 г. Прието на 3 август 2006 г.

Цялото съдържание на това списание, с изключение на случаите, когато е отбелязано друго, е лицензирано под лиценз Creative Commons Attribution