Резюме

Въведение

Разпространението на затлъстяването се е увеличило драстично през последните три десетилетия (1), допринасяйки за увеличаване на разпространението на диабет тип 2 (2). Тази връзка е до голяма степен медиирана от инсулинова резистентност, която засяга 30% от възрастното население на САЩ (3) и е линейно свързана с затлъстяването (4). Изглежда, че тази връзка е причинно-следствена, тъй като диетичната и хирургична загуба на тегло води до трайно подобряване на инсулиновата чувствителност сред хората с IR (5). Хората с наднормено тегло и умерено затлъстяване, които съставляват 60% от възрастните в САЩ, са метаболитно хетерогенни и инсулиновата резистентност може да варира повече от шест пъти при всеки даден ИТМ в този диапазон (6). Защо някои индивиди развиват инсулинова резистентност в условията на излишно телесно тегло, а други изглеждат „защитени“, не е напълно изяснено. Като се има предвид, че затлъстяването не е синоним на инсулинова резистентност, вероятно биологичните характеристики на мастната тъкан на клетъчно и молекулярно ниво и/или регионалното разпределение допринасят за инсулиновата чувствителност над мастната маса като такава.

мастните

За да проверим хипотезата, че относителната неспособност на адипоцитите да съхраняват TG в подкожната мастна тъкан (SAT) допринася за свързаната със затлъстяването инсулинова резистентност, ние създадохме проучване за прехранване при лица с наднормено тегло до умерено затлъстяване, класифицирани като IS или IR, чиито мастни клетки ще бъде близо или с максимален капацитет за съхранение и който вероятно ще покаже диференцирани реакции на мастните клетки и тъкани на допълнителни изисквания за съхранение на TG. Ние предположихме, че в отговор на умерено наддаване на тегло, IR пациентите ще демонстрират характеристики на нарушена диференциация на адипоцитите и съхранение на TG, включително хипертрофия на адипоцитите, липолиза/повишена циркулираща свободна мастна киселина (FFA), отлагане на мазнини във висцерални и интрахепатални депа и влошаване на инсулина съпротива. Субектите от IS, които предположихме, поради засилената способност за диференциране и набиране на нови мастни клетки, ще бъдат защитени от хипертрофия на адипоцитите, отлагане на извънматочна мастна тъкан, липолиза и/или влошаване на инсулиновата резистентност.

Изследователски дизайн и методи

Субекти

Инсулин-медиирано усвояване на глюкоза

Биопсия на мастна тъкан

Мастната тъкан се получава при стерилни условия и локална анестезия. Направен е 1-сантиметров разрез на скалпел по-нисък от пъпа, от който са отстранени 2 g SAT. Две проби от 20–30 mg тъкан веднага се фиксират в осмиев тетроксид и се инкубират във водна баня при 37 ° С в продължение на 48 часа, както е описано по-рано (7), след което размерът на мастните клетки се определя с помощта на Multisizer 3 Coulter Counter ( Beckman Coulter, Маями, Флорида) с отвор от 400 μm. Ефективният диапазон на размера на клетките, използващ тази апертура, е от 20 до 240 μm. Данните, усреднени от двете дублирани тъканни проби, са изразени като брой клетки при всеки диаметър на клетката, което дава хистограма на честотата.

Анализът на разпределението на размера на мастните клетки от графика на Multisizer (фиг. 1А) включва за всеки субект идентификация на „надира“, дефиниран като средната точка, между която две клетъчни популации обикновено присъстват с повишена честота. „Процент малки клетки“ е дефиниран като процент на мастните клетки под надира, а „пиков диаметър“ е определен като диаметърът, при който честотата на голямата популация на мастните клетки достига връх. По-рано показахме, че тези мерки са по-описателни от средния или средния размер на клетката (7,8).

Представителните профили на Beckman Multisizer за разпределение на размера на мастните клетки са показани при два IS и два IR субекта на изходно ниво (PRE) и при пиково тегло (POST). Надир, обозначен с отворена стрелка, разделя две популации от малки клетки, разпределени като двойна експоненциална опашка вляво от надир, и големи клетки, разпределени като крива на Гаус. Черната стрелка показва диаметър на върха (център на кривата на Гаус).

Измерване на генната експресия на мастна тъкан

От по-голям анализ на наностринг на 20 субекта в тази кохорта, ние избрахме 10 липогенни гена, които да анализираме за инсулинова резистентност и отговор на наддаване на тегло. РНК се изолира от комплекта за екстракция на Hybrid-R RNA (GeneAll BioTechnologies, Palo Alto, CA) в съответствие с инструкциите на производителя. Количеството и качеството на РНК се проверяват чрез анализ на Bioanalyzer. Пробите от РНК бяха изпратени до Станфордския геномен център за анализ. В анализа бяха включени реплики между и вътре в патрон. Нормализирането на резултатите от nCounter е направено с помощта на софтуер за анализ nSolver, версия 2.5 (NanoString Technologies), съгласно указанията на производителя. Броят на РНК се нормализира, като се използва експресията на четири референтни гена (GAPDH, CLTC, GUSB и HPRT1) и положителни контроли във всяка проба, както е описано по-рано (25). Експресията на изходния ген за всеки субект се изразява по отношение на единичен контролен субект на IS и промяната на сгъване от изходното ниво при пиково тегло се изчислява за всеки индивид спрямо изходната им стойност.

Диетична намеса

На всички субекти беше дадена контролирана хиперкалорична диета с излишък на калории на ден, за да се предизвика 3.2-килограмово наддаване за 4 седмици, последвано от 1 седмица стабилизиране на теглото преди повторение на метаболитни, радиологични и мастни мерки. Преди изходната биопсия, пациентите са инструктирани да избягват екстремен състав на макроелементи, да се хранят повече от веднъж седмично и да употребяват алкохолни напитки повече от една на ден за жени или повече от две на ден за мъже. До и подсладени с фруктоза напитки на ден бяха разрешени преди и по време на наддаване на тегло. Тридневни хранителни дневници бяха получени на изходно ниво и при седмични посещения по време на проучването и данните бяха въведени в хранителния процесор на ESHA за анализ на данните.

След изходната биопсия субектите започнаха периода на наддаване на тегло, като добавиха средно 880 калории/ден в допълнение към обичайния си дневен прием. Точен калориен излишък, приложен от изследовател диетолог като закуски и напитки, с фиксиран състав на макроелементи от 50% въглехидрати, 35% мазнини (Вижте тази таблица:

  • Преглед на линия
  • Преглед на изскачащия прозорец

Сравнение на демографските и клиничните характеристики

Сравненията на изходните регионални и интрахепатални мазнини (IHL), коригирани за ИТМ и пол, са докладвани в Таблица 1. SAT и мазнините в бедрото са значително по-големи в групата с IS. ДДС и% ДДС бяха значително по-високи в подгрупата IR, а IHL беше почти осем пъти по-голям. Промените в тези променливи с увеличаване на теглото и разликите между групите при пиково тегло са обсъдени по-долу. Базовите разлики в размера и разпределението на мастните клетки са показани на фиг. 2А. IR пациентите са имали значително по-голям диаметър на пика, по-висок надир и по-голям процент малки клетки от субектите с IS.

Измерва размера и разпределението на мастните клетки при субекти с IS и IR на изходно ниво (A) и промени с увеличаване на теглото за диаметър на върха (B), надир (C) и процент на малки клетки (D). Средно ± SEM, анализирано чрез ANCOVA с корекция за% BF (A) или сдвоен тест на Student t (B, C и D). Диаметър, диаметър.

Сравнения на промените в клиничните променливи от изходното ниво

Промените в регионалното разпределение на мазнините разкриват увеличение на SAT в групите IS и IR, което достига статистическа значимост само в групата IR. Въпреки това, ДДС и% ДДС, макар и по-високи на изходно ниво в IR групата, се увеличиха значително само при субектите на IS. Промените в мазнините на бедрото не са статистически значими и при двете групи. И накрая, IHL се увеличи значително и в двете групи с наддаване на тегло, с по-голям абсолютен, но по-малък относителен (30% срещу 133%) прираст в IR групата.

Промените в размера и разпределението на мастните клетки след увеличаване на теглото, показани на фиг. 2B-D, също се различават според IS/IR групата. Диаметърът на пика се е увеличил и в двете групи, но тази промяна е била статистически значима само в групата с IS (108 ± 15 до 115 ± 14 μm [P = 0,015] спрямо 120 ± 16 до 125 ± 13 μm [P = 0,31]). Надирът се измества значително надясно в групата на IS (P = 0,012), но не се променя в групата с IR и процентът на малките клетки намалява значително в IS (P = 0,029), но не и в групата с IR.

Генната експресия

Подобно на клиничните данни и данни за размера на клетките, гените, отразяващи метаболитно активните мастни клетки, са били регулирани в началото на IS в сравнение с IR групата, след корекция за% BF (Таблица 2). Те включват липиден метаболизъм (липогенен и липолитичен) и гени за усвояване на глюкоза. Експресиите на липогенни и липолитични гени са силно корелирани (данните не са показани). Също подобно на клиничните данни и данните за размера на клетките, експресията на гени за липиден метаболизъм намалява значително с прехранване само в групата на IS, докато GLUT4 се увеличава значително в IR, но не и в групата на IS, като по този начин демонстрира значително различни модели на промяна в IS спрямо субектите с IR.

Относителна експресия на гени, свързани с усвояването на глюкоза и липидния метаболизъм в мастната тъкан от субекти с ИС и IR в началото и промени с увеличаване на теглото

Изходни предиктори на ΔSSPG

От изходните предиктори, които представляват интерес, включително ДДС, SAT, IHL, диаметър на пика и процент на малки клетки, след корекция за Δ% BF, единственият независим предиктор на ΔSSPG е диаметърът на пика на мастните клетки, който е обратно свързан с ΔSSPG: колкото по-големи са клетките на изходно ниво, толкова по-малко SSPG се променя с увеличаване на теглото (r = -0,62, P = 0,008).

Промяна в променливите като предиктори на ΔSSPG

Промени, свързани с повишаване на теглото при четири променливи, са значително свързани с влошаване на инсулиновата резистентност след коригиране на Δ% BF и IR/IS група. В групата като цяло, ΔVAT, IIHL и Δpeak диаметър, всички значително прогнозират ΔSSPG (P = 0,028, P = 0,004 и P = 0,04, съответно) и трите демонстрират взаимодействие с IS/IR група (P = 0,025, P = 0,006 и P = 0,04, съответно). Линейните регресионни анализи от IR/IS група показаха, че само в IS групата, ΔVAT, ΔIHL и Δ пиковият диаметър са пряко и значително свързани с ΔSSPG, както е показано на фиг. 3. Δ Инсулиновото потискане на липолизата (концентрация на FFA в стабилно състояние) също независимо предсказано ΔSSPG, (r = 0,60, P = 0,04), без взаимодействие по групи. Други променливи на адипоцитите, регионалните мазнини и FFA не прогнозират ΔSSPG.

Промяна в инсулиновата резистентност, измерена чрез SSPG, като функция от ΔVAT, IHL (Lipid/H2O) и пиковия диаметър на мастните клетки при IS (вляво) и IR (вдясно) при хората. Обща линейна регресия с настройка за Δ% BF. Отчитат се стандартизирани стойности на r и P.

Спомагателни анализи

Изследването дали характеристиките на мастните клетки предсказват промяна в регионалните депа за мазнини разкрива, че по-малкият диаметър на пиковия изход и по-високият процент на малките клетки прогнозират ΔVAT независимо от Δ% BF (r = 0,42, P = 0,03 и r = 0,40, P = 0,03, съответно). ΔPak диаметър прогнозира ΔIHL (r = 0,81, P = 0,029) със значимо групово взаимодействие (P = 0,017), но анализът на страничните групи разкрива значителна връзка само в групата IS (P = 0,026).

Дискусия

За разлика от нашата хипотеза, че субектите с IS ще демонстрират адаптивна мастна тъкан и метаболитни отговори на наддаване на тегло, ние открихме обратното: субектите с IS показаха неадаптивни реакции на мастната тъкан и развиха клинично значима инсулинова резистентност. Мастната маса се разширява във висцералните и интрахепаталните депа и е очевидна хипертрофия на мастните клетки. Концентрациите на FFA при стационарни инсулинови условия се повишават с 133%, което показва резистентност към инсулинова супресия на липолиза, докато AUC концентрациите на FFA след стандартизирано тестово хранене не се повишават, вероятно поради съпътстващо повишаване на AUC на инсулина. Мускулната инсулинова резистентност, измерена чрез SSPG, се влошава с 45% в групата с IS в сравнение с 8% в групата с IR с подобно наддаване на тегло. Интересното е, че степента на промяна във всички тези променливи, включително ДДС, IHL, диаметър на пиковите мастни клетки и инсулиново потискане на липолизата, значително прогнозира степента, до която SSPG се влошава. Освен това тези асоциации са независими от увеличаването на теглото само по себе си, което предполага, че различните клетъчни и регионални модели на разпределение на мазнините в мастната тъкан могат да допринесат за метаболитната хетерогенност на затлъстяването.

Интересното е, че с изключение на IHL, който се увеличи значително и в двете групи, и SAT, който се увеличи значително само в IR групата, значителни промени в променливите на мастната тъкан бяха ограничени до групата IS. Освен това, с изключение на Δинсулиновото потискане на липолизата, което корелира с ΔSSPG и в двете групи, корелациите между промяната в тези променливи (ДДС, IHL, диаметър на пика) и ΔSSPG също са ограничени до групата IS.

Резултатите, представени в това проучване, също имат важни биологични последици. Механизмите, свързващи излишните телесни мазнини с инсулиновата резистентност, все още не са ясни. Една хипотеза твърди, че хипертрофията на адипоцитите причинява инсулинова резистентност. Предварителна подкрепа за тази хипотеза се намира в проучвания на напречно сечение при животни, in vitro и хора. Настоящите резултати разширяват тези данни, като демонстрират, че степента на увеличаване на мастните клетки в резултат на увеличаване на теглото при здрави хора с наднормено тегло е независимо свързана с развитието на инсулинова резистентност. По извода хипертрофията на адипоцитите отразява нарушената диференциация на новите клетки в условията на повишени изисквания за съхранение на TG. Обхватът на „нарушена диференциация“ включва намалена пролиферация и/или ангажираност на нови преадипоцити, диференциация на преадипоцити и дисфункционално терминално съзряване, водещо до намален капацитет за съхранение на TG. Алтернативно обяснение за уголемени мастни клетки би било присъщо повишен капацитет за съхранение на TG, потенциално поради разлики в липидния метаболизъм, кръвоснабдяването или външното ограничение.

Това, че нашите IR пациенти не са имали значително увеличаване на мастните клетки или влошаване на IS е интересно, особено защото те не са били в горната граница на разпределението на SSPG. По същия начин те не са имали значително разширяване на ДДС, въпреки че SAT и IHL са се увеличили значително. Всъщност, комбинираното увеличение на измерените мазнини (SAT, ДДС, бедро) е 17 cm 3 в IR спрямо 29 cm 3 в групата на IS, въпреки подобно увеличаване на теглото, което предполага потенциално отлагане на мазнини в неизмерени депа в IR групата. Високият капацитет сред субектите с IR да съхраняват мазнини в черния дроб може да отразява тенденцията за натрупване на мазнини в други неизмерени ектопични места, което може да обясни липсата на хипертрофия на адипоцитите и относително ниското „измерено“ разширение на мастната маса. Алтернативно, относителната защита от по-нататъшна адипоцитна хипертрофия и метаболитна декомпенсация сред индивиди с IR може да е резултат от повишено регулиране на гените за диференциация на адипоцитите в хронично стресирани адипоцити, в съответствие със значително увеличение на SAT сред субекти с IR.

Нашите открития са частично подкрепени от две публикации (30,31), показващи, че индивиди с по-малки подкожни мастни клетки на корема в изходно ниво са имали по-голямо клетъчно разширяване (30) и по-голямо намаляване на IS (31). В тези проучвания съответно субектите са по-слаби (22,1 ± 0,5 и 25,5 ± 2,3 kg/m 2), по-млади (27–29 години) и имат по-продължителен период на наддаване на тегло (4,6 и 7,6 kg за 8 седмици). Освен това, както нашите констатации, второто проучване показа, че по-малкият изходен размер на мастните клетки предсказва по-голямо увеличение на% ДДС, но не и IHL или SAT. Не се съобщава нито за промяна в размера на мастните клетки, нито за връзката с развитието на инсулинова резистентност. Друго проучване за прехранване (32) при значително по-тежки субекти (ИТМ 36,6 ± 4 kg/m 2), класифицирано като метаболитно нормално или метаболитно аномално затлъстяване (MAO), показва, че MAO, подобно на нашата IR група, показва по-голямо увеличение на абсолютния IHL в отговор на наддаване на тегло, концентрации на TG и VLDL и чернодробна инсулинова резистентност. За разлика от нашите резултати, чувствителността на мастната тъкан и мускулната инсулин се влошава при МАО субектите. Излишъкът на калории, получен от ресторанти за бързо хранене или по-тежки ИТМ при тези пациенти, може да е допринесъл за различни резултати.

Ограниченията на проучването включват възможна липса на обобщаемост за жени в пременопауза и афроамериканци или испанци. Установихме, че азиатците, когато се съпоставят за инсулинова резистентност, демонстрират изходни характеристики и характеристики за наддаване на тегло, които са почти идентични с тези в кавказките в това проучване. В допълнение, не успяхме да извършим биопсия на множество депа поради и без това голяма тежест на субекта, така че дали промените в размера/разпределението на мастните клетки са възникнали в други депа за телесни мазнини е неясно. И накрая, установяването на причинно-следствена връзка в изследванията върху хора е трудно. В настоящото проучване наддаването на тегло беше манипулирано, което доведе до промени в променливите на мастната тъкан, които бяха значително свързани с развитието на инсулинова резистентност, което предполага, но не доказва причинност.

В заключение, настоящите резултати осигуряват силна подкрепа за хипотезата, че нарушената функция на мастните клетки допринася за метаболитната хетерогенност на затлъстяването. Резултатите уникално показват важността на увеличаването на мастните клетки, заедно с намалена експресия на липогенни гени и разширяване на ДДС и IHL като потенциални медиатори на свързаната със затлъстяването инсулинова резистентност. Освен това, те демонстрират, че субектите с ИС не са защитени от метаболитно влошаване по време на наддаване на тегло, вероятно претърпявайки ранен етап на декомпенсация, тъй като те се доближават до фенотипа, проявен от IR субектите. Необходими са допълнителни изследвания, за да се определи какво задвижва или предотвратява хипертрофията на адипоцитите и какви клетъчни и молекулярни процеси се активират, които свързват увеличаването на мастните клетки и разширяването на ДДС и IHL със системна инсулинова резистентност.

Информация за статия

Финансиране. Тази работа беше подкрепена от гранта на Американската диабетна асоциация 1-11-CT-35.

Двойственост на интересите. Не са докладвани потенциални конфликти на интереси, свързани с тази статия.

Принос на автора. T.M.L. ръководи проучването и провежда метаболитните тестове и биопсии на мазнини, подготвя данни и допринася за ръкописа. C.C., D.P. и C.A. ръководеше записването, клиничните посещения, събирането на данни и спазването на етичните изисквания на хората. L.-F.L. ръководи всички лабораторни аспекти. D.S.наблюдаваше чернодробни образни изследвания. S.W.C. допринесе за дизайн на изследването и интерпретация на данни и анализира проби от мастна тъкан за данни за размера на клетките. T.M.L. е гарант за тази работа и като такъв е имал пълен достъп до всички данни в проучването и поема отговорност за целостта на данните и точността на анализа на данните.

Предварително представяне. Части от това проучване бяха представени в абстрактна форма на 74-те научни сесии на Американската диабетна асоциация, Сан Франциско, Калифорния, 13-17 юни 2014 г.