А.Н. Белозерски институт по физико-химична биология, М.В. Московски държавен университет „Ломоносов“, Русия

В. И. Кулаков Изследователски център по акушерство, гинекология и перинатология, Министерство на здравеопазването на Руската федерация, Москва, Русия

Кореспонденция

Е. Й. Плотников или Д. Б. Зоров, Лаборатория. Структура и функции на митохондриите, А.Н. Институт "Белозерски", Московски държавен университет "Ломоносов", Москва 119992, Русия

Факс: +7 495 939 3180

Тел: +7 495 939 5944

А.Н. Белозерски институт по физико-химична биология, М.В. Московски държавен университет „Ломоносов“, Русия

Руски изследователски и производствен център по кардиология, Москва, Русия

А.Н. Белозерски институт по физико-химична биология, М.В. Московски държавен университет „Ломоносов“, Русия

В. И. Кулаков Изследователски център по акушерство, гинекология и перинатология, Министерство на здравеопазването на Руската федерация, Москва, Русия

А.Н. Белозерски институт по физико-химична биология, М.В. Московски държавен университет „Ломоносов“, Русия

В. И. Кулаков Изследователски център по акушерство, гинекология и перинатология, Министерство на здравеопазването на Руската федерация, Москва, Русия

Международен лазерен център, М.В. Московски държавен университет „Ломоносов“, Русия

А.Н. Белозерски институт по физико-химична биология, М.В. Московски държавен университет „Ломоносов“, Русия

А.Н. Белозерски институт по физико-химична биология, М.В. Московски държавен университет „Ломоносов“, Русия

В. И. Кулаков Изследователски център по акушерство, гинекология и перинатология, Министерство на здравеопазването на Руската федерация, Москва, Русия

В. И. Кулаков Изследователски център по акушерство, гинекология и перинатология, Министерство на здравеопазването на Руската федерация, Москва, Русия

А.Н. Белозерски институт по физико-химична биология, М.В. Московски държавен университет „Ломоносов“, Русия

В. И. Кулаков Изследователски център по акушерство, гинекология и перинатология, Министерство на здравеопазването на Руската федерация, Москва, Русия

Кореспонденция

Е. Й. Плотников или Д. Б. Зоров, Лаборатория. Структура и функции на митохондриите, А.Н. Институт "Белозерски", Московски държавен университет "Ломоносов", Москва 119992, Русия

Факс: +7 495 939 3180

Тел: +7 495 939 5944

А.Н. Белозерски институт по физико-химична биология, М.В. Московски държавен университет „Ломоносов“, Русия

В. И. Кулаков Изследователски център по акушерство, гинекология и перинатология, Министерство на здравеопазването на Руската федерация, Москва, Русия

Кореспонденция

Е. Й. Плотников или Д. Б. Зоров, Лаборатория. Структура и функции на митохондриите, А.Н. Институт "Белозерски", Московски държавен университет "Ломоносов", Москва 119992, Русия

Факс: +7 495 939 3180

Тел: +7 495 939 5944

А.Н. Белозерски институт по физико-химична биология, М.В. Московски държавен университет „Ломоносов“, Русия

Руски изследователски и производствен център по кардиология, Москва, Русия

А.Н. Белозерски институт по физико-химична биология, М.В. Московски държавен университет „Ломоносов“, Русия

В. И. Кулаков Изследователски център по акушерство, гинекология и перинатология, Министерство на здравеопазването на Руската федерация, Москва, Русия

А.Н. Белозерски институт по физико-химична биология, М.В. Московски държавен университет „Ломоносов“, Русия

В. И. Кулаков Изследователски център по акушерство, гинекология и перинатология, Министерство на здравеопазването на Руската федерация, Москва, Русия

Международен лазерен център, М.В. Московски държавен университет „Ломоносов“, Русия

А.Н. Белозерски институт по физико-химична биология, М.В. Московски държавен университет „Ломоносов“, Русия

А.Н. Белозерски институт по физико-химична биология, М.В. Московски държавен университет „Ломоносов“, Русия

В. И. Кулаков Изследователски център по акушерство, гинекология и перинатология, Министерство на здравеопазването на Руската федерация, Москва, Русия

В. И. Кулаков Изследователски център по акушерство, гинекология и перинатология, Министерство на здравеопазването на Руската федерация, Москва, Русия

А.Н. Белозерски институт по физико-химична биология, М.В. Московски държавен университет „Ломоносов“, Русия

В. И. Кулаков Изследователски център по акушерство, гинекология и перинатология, Министерство на здравеопазването на Руската федерация, Москва, Русия

Кореспонденция

Е. Й. Плотников или Д. Б. Зоров, Лаборатория. Структура и функции на митохондриите, A.N. Институт "Белозерски", Московски държавен университет "Ломоносов", Москва 119992, Русия

Факс: +7 495 939 3180

Тел: +7 495 939 5944

Резюме

Съкращения

Въведение

Новородените бебета са силно податливи на бъбречна исхемия и когато тя е продължителна и персистираща, се развива остра тубуларна или кортикална некроза с по-нататъшен паренхимен оток и затрупване на некротични тубуларни епителни клетки в тръбния лумен [9]. Възможно е всичко да се дължи на незрялост на бъбрека на новороденото по време на раждането с продължаване на функционалното съзряване в постнаталния период [10] .

Тези патологични механизми на индуцирано от исхемия бъбречно увреждане са универсални, но те могат да бъдат различни при сравняване на ефекта на хипоксия върху бъбреците на възрастни и новородени плъхове. Показано е, че последните претърпяват обратимо клетъчно увреждане, докато при възрастни плъхове епителът на бъбречните каналчета трайно губи функцията на реабсорбция [11] .

Спецификата на функционирането на развиващия се бъбрек при новородени при норма и патология определя различни изисквания към маркерите на увреждане [12, 13]. Например, през първите дни от живота настъпва установяването на бъбречната функция и физиологичната олигурия може да закрие АКИ. Класическите маркери на бъбречната недостатъчност креатинин и урея стават само късни маркери на увреждането, силно зависими от диетата, функциите на скелетните мускули и стабилността на бъбречното функциониране [13]. За да се наблюдава повишен серумен креатинин при новородени, се изисква загуба на около 75% от функционалните нефрони (при възрастни - 50%), а повишаването му се наблюдава само след 24–48 часа. Съответно, нови маркери на AKI: свързаният с неутрофилен желатиназа липокалин (NGAL) и молекула на бъбречно увреждане-1 (KIM-1) започнаха да се използват в клиники и тяхното приложение в неонатологията изглежда разумно, когато е оправдано [14] .

Специфичността, чувствителността и времето на увеличаване на новите маркери в урината ги прави незаменими в клиничната практика: употребата на NGAL постепенно се включва в рутинната диагностична процедура при контрастна нефропатия, но използването им в неонатологията все още е експериментално и са необходими допълнителни проучвания.

В това проучване ние оценихме възможността за използване на новородени плъхове като модел на новородени AKI, индуцирани от хипоксия и системно възпаление, причинено от ендотоксин [(липополизахарид (LPS)]. Целта беше да се получи представа за механизмите на бъбречното увреждане при експериментална нефропатия със значение на оксидативния стрес и с използването на антиоксиданти, за да се осигури нефропротекция.

Резултати

Остра бъбречна травма при новородени след лечение с хипоксия и LPS

Както инжектирането на LPS, така и тоталната хипоксия на плъхове водят до остро бъбречно увреждане. Двадесет и четири часа след прилагане на LPS се наблюдава значително увеличение на азота в уреята в кръвта (BUN), докато по време на хипоксия нивото на BUN не се променя (фиг. 1А). Докато по този показател бъбречната недостатъчност се наблюдава само след излагане на LPS, други Area маркери за карбамид NGAL и KIM-1, открити в урината, демонстрират наличие на бъбречно увреждане и в двете групи (фиг. 1В, С). Двадесет и четири часа след хипоксия, увеличението на KIM-1 в урината е малко, но статистически значимо (P ≤ 0,05), докато след въвеждането на LPS нивата на NGAL и KIM ‐ 1 са увеличени многократно (P

остро

Хистопатологични промени в бъбречната тъкан след лечение с хипоксия и LPS

Хистологичното проучване разкрива промени в морфологията на бъбреците, предизвикани както от хипоксия, така и от инжектиране на LPS (фиг. 2А, В). Промените, наблюдавани в бъбреците 24 часа след хипоксия и LPS, изглежда показват силна тубуларна дилатация, измерена като увеличаване на тръбна лумена (фиг. 2С) и увеличена средна площ на тубулите в медулата (фиг. 2D) Освен това площта, заета от гломерули в групи LPS и хипоксия, е значително намалена (фиг. 2Е), което може да показва развитието на гломерулна склероза. Седемдесет и два часа след излагане на LPS или хипоксия, патологичните промени вече са се проявили в по-малка степен (Фиг. 3). Значителни разлики са наблюдавани само в областта на тубулите в медулата (фиг. 3D) и само в групата, лекувана с LPS.

Лечението с LPS предизвиква оксидативен стрес в новородените бъбреци

Тъй като разкрихме, че най-увреждащият ефект върху бъбреците на новородени плъхове е предизвикан от LPS, бяха проведени допълнителни експерименти, използващи този модел. Наблюдавахме, че производството на реактивни кислородни видове (ROS), установено чрез флуоресценция на DCF във жизнени участъци на кората, е значително по-високо в бъбреците на малките, изложени на LPS, в сравнение с контролите (фиг. 4А, В), показващи появата на оксидативен стрес.

н‐Ацетил цистеин (NAC) спасява бъбрека от вредните ефекти на LPS

Дискусия

В това проучване новородените плъхове са използвани в модел на новородени AKI, провокирани от различни фактори, най-често срещани в клиничната практика, а именно тотална хипоксия (като аналог на фетална хипоксия и новородена асфиксия) и въвеждането на LPS, симулиращ неонатален сепсис . Очевидно е, че основата на транслацията на хората на всички експериментални данни, получени при животни като цяло и по-специално при плъхове, е сравнението на нефрогенезата и физиологията на бъбреците на бебето и плъх, което в крайна сметка влияе върху механизмите на увреждане и възстановяване на бъбрека.

Пери- и неонаталните патологии като отлепване на плацентата, интрапартална хипоксия, асфиксия, сепсис, могат да доведат до централизация на кръвния поток и в крайна сметка до исхемия/реперфузия на органи като бъбреците. Общоприето е, че реперфузионното увреждане е свързано с оксидативен стрес, който се причинява главно от митохондриална дисфункция [20, 21]. Освен това, подобни увреждания на митохондриалната система и хиперпродукцията на ROS и други свободни радикали се наблюдават в бъбреците при други патологии, например при токсична миоглобинурия или пиелонефрит [22]. Можем да предположим, че този патологичен механизъм е универсален и добре доказан за бъбреците на възрастни животни, но подобни явления са описани за бъбречно увреждане при малките плъхове, например при хипероксично увреждане на бъбреците, водещо до фиброза [23] и вътрематочна асфиксия причиняващи AKI [24]. Въпреки това, при сравняване на ефекта на хипоксия върху бъбреците на възрастни и новородени плъхове, последните демонстрират обратимо клетъчно увреждане, докато при възрастни плъхове епителът на бъбречните каналчета постоянно губи функцията на реабсорбция [11] .

По-нататъшното проучване на механизмите на неонатално увреждане на бъбреците, причинено от LPS, разкрива основната роля на оксидативния стрес в този процес. След 3 часа интраперитонеално приложение на LPS се открива повишена продукция на ROS в бъбречните тубули на плъхове. Това показва, че оксидативният стрес може да е причина за бъбречно увреждане, докато маркерите за бъбречно увреждане през този период все още не могат да бъдат открити в урината (данните не са показани). Тези данни са в добро съгласие с известните факти за ролята на окислителното увреждане на бъбреците при сепсис и SIRS при възрастни животни [27, 28]. Въз основа на основната роля на оксидативния стрес, ние се опитахме да излекуваме LPS-индуцираната нефропатия с антиоксидант NAC. NAC е един от класическите антиоксиданти, използвани в експериментални изследвания и неговите нефропротективни ефекти са демонстрирани в много модели, свързани с оксидативен взрив като бъбречна исхемия [29], рабдомиолиза [30] и индуцирана от гентамицин нефропатия [31] .

Материали и методи

Експерименти с животни

В работата бяха използвани безплодни бели плъхове, държани в помещение за отглеждане на животни с 12-часов светлинен цикъл при постоянна температура (22 ± 2 ° C). Експериментите са проведени в съответствие с етичните стандарти и препоръки за настаняване и грижи за лабораторни животни, обхванати от Директивите на Съвета на Европейската общност 2010/63/ЕС относно използването на животни за експериментални изследвания. Броят на малките в едно котило е 9–12. Експериментите са проведени върху 7-дневни малки от двата пола с тегло 9-14 g.

Моделиране на хипоксични и септични увреждания

Плъхове от едно котило бяха разделени на случаен принцип в три групи: Контрол, непокътнати животни; Хипоксия, плъхове с хипоксия; LPS, плъхове, които са получили инжекция LPS. Общият брой на животните във всяка група е 12 (от различни котила). В групата с хипоксия плъховете бяха подложени на 2 h системна хипоксия в многогазов инкубатор NewBrunswick в атмосфера, съдържаща 8% кислород и 92% азот при температура 37 ° С. Животните от групата LPS се инжектират веднъж интраперитонеално с LPS от Ешерихия коли щам 0127: B8 (Sigma-Aldrich, Сейнт Луис, Мисури, САЩ) в доза от 4 mg · kg -1. След излагане животните бяха върнати на майките си и след 24 и 72 часа бяха взети проби от кръв и урина и бъбреци за вестерн-блотинг и хистологично изследване.

Уестърн блотинг

За анализ на маркери на бъбречно увреждане, KIM ‐ 1 и NGAL, използвахме урина, събрана от малките 24 часа и 72 часа след лечението. За вземане на проби урината се разрежда четирикратно в пробен буфер, съдържащ 10% 2-меркаптоетанол. Пробите се варят 5 минути и 20 μL от пробата се поставят в ямката на гела.

Маркер за клетъчна пролиферация, PCNA е открит в бъбречни хомогенати. Животното беше евтаназирано, след което бъбреците бяха отстранени и бързо охладени в PBS. Бъбреците се натрошават на фрагменти и след това се хомогенизират в 0,5 ml PBS, съдържащ 1 mmol·L -1 -1 протеазен инхибитор PMSF. Полученият хомогенат се центрофугира при 1500 ж за 3 минути супернатантата се смесва с 4х пробен буфер, съдържащ 10% 2-меркаптоетанол, и се вари 5 минути. Аликвотна част от супернатанта беше използвана за определяне на концентрацията на общия протеин, като се използва търговски комплект на базата на бицинхонинова киселина (Sigma-Aldrich). Всяка ямка в гела съдържаше същото количество протеин.

Електрофореза на протеини се извършва в полиакриламиден гел при денатуриращи условия от Laemmli. Отделените протеини се прехвърлят върху мембраната на поливинилиден дифлуорид (Amersham Pharmacia Biotech, Rainham, Великобритания) чрез полусухо попиване. Мембраните бяха блокирани за 1 h при 25 ° C в PBS с 5% обезмаслено сухо мляко и 0,05% Tween-20, инкубирани с първични антитела срещу NGAL, KIM-1 (Abcam, Cambridge, UK) и PCNA (Abcam) при разреждане от 1: 1000 в PBS/BSA/Tween-20 и след това с вторични антитела, конюгирани с хрянова пероксидаза при разреждане 1: 10000 в PBS/Tween-20. Ленти бяха открити с помощта на хемилуминесцентен субстрат за хемилуминесцентна система, подобрена с хрян (ECL; Amersham Pharmacia Biotech). Хемилуминесценцията беше открита с инструмент за обработка на изображения MP ChemiDoc MP (Bio-Rad, Hercules, CA, USA), получените изображения бяха анализирани с помощта на софтуера за лабораторни изображения 6.0 (Bio-Rad).

Бъбречна хистология

Бъбрекът се изолира веднага след умъртвяването на животното, измива се с ледено охладен с фосфат буфериран физиологичен разтвор, фиксира се в 10% буфериран формалин, вгражда се в парафин и се използва за хистопатологично изследване. Разрези с дебелина пет микрометра бяха изрязани, депарафинизирани, хидратирани и оцветени с хематоксилин и еозин. Бъбречните секции бяха изследвани сляпо с инвертиран микроскоп Axiovert (Carl Zeiss Inc., Йена, Германия). Изследвани са минимум 10 полета за всеки плъзгач на бъбреците и са оценени за патологична тежест. Морфометричният анализ беше извършен с помощта на софтуера imagej (NIH, Bethesda, MD, USA).

Конфокална микроскопия

Експериментите бяха проведени при 20 ° С. Бъбречните филийки бяха получени с вибрационен микротом Vibroslice (WPI, Sarasota, FL, USA), измити в DMEM и инкубирани с 10 μm DCF-DA за 10 минути. След измиване на остатъчния DCF, резените се изобразяват с LSM510 обърнат конфокален микроскоп (Carl Zeiss Inc.). Анализът на включването на флуорохром се извършва в съдове със стъклено дъно с възбуждане при 488 nm и емисия, събрана при 500–530 nm. За да се сведе до минимум приносът на индуцираните от фотото митохондрии/клетъчни увреждания към относителната интензивност на флуоресценцията, анализът на изображението беше извършен средно само за първите четири сканирания. Изображенията са обработени с помощта на софтуера imagej (NIH).

Статистика

Всички данни са представени като средно ± SEM. Сравненията между групите бяха направени с помощта на Student’s т тест и с тест на Ман – Уитни с a P стойност

Благодарности

Тази работа е подкрепена с безвъзмездна помощ от RFBR 17‐04‐01045.

Конфликт на интереси

Авторите декларират, че нямат конфликт на интереси.

Авторски приноси

EYP проектира експерименти, извършва експерименти с конфокална микроскопия, анализира данни и редактира статията; TAP и DNS извършват експерименти с животни и анализират хистологични данни; IBP и LDZ извършват уестърн блотинг; VNM извърши хистологично изследване; GTS и DBZ дефинираха концепцията на изследването, контролираха експериментите, анализираха литературата и написаха ръкописа.