• Намерете този автор в Google Scholar
  • Намерете този автор в PubMed
  • Потърсете този автор на този сайт
  • За кореспонденция: zgdong @ hi.umn.edub.li @ louisville.edu

Редактирано от Peter K. Vogt, The Scripps Research Institute, La Jolla, CA, и одобрено на 20 октомври 2017 г. (получено за преглед на 14 юни 2017 г.)

rsk2

Значимост

Много пациенти с колоректален рак умират поради метастази в отдалечени органи като черния дроб и белите дробове, а не от първичния тумор. По-доброто молекулярно разбиране на колоректалния рак позволи подобряване на прогнозата на пациента и пускането на прецизни лекарства за лечение на метастатичен колоректален рак. Тук демонстрираме, че дефицитът на рибозомна S6 киназа 2 (RSK2) може да доведе до драстично намалена секреция на IFNγ чрез неподходящ статус на фосфорилиране на T-bet, модулатор на експресията на IFNγ. Намалените нива на IFNγ могат да доведат до имунна супресия, ускорявайки метастази в черния дроб и белия дроб, медиирани от рак на дебелото черво. Установихме, че RSK2-медиираното фосфорилиране на T-bet при серини 498 и 502 е необходимо за инхибиране на метастази и растеж на рак на дебелото черво, чрез положителна регулация на RSK2/T-bet/IFNγ сигнализиране.

Резюме

Метастазите са основна причина за смърт при пациенти с рак (1). Метастазите в черния дроб са ракови тумори, които са се разпространили от друга част на тялото в черния дроб. Повечето случаи на чернодробни метастази се развиват от рак на дебелото черво или ректума; всъщност ~ 80% и 20% от пациентите с колоректален рак развиват съответно метастази в черния дроб и белите дробове (2, 3). Метастазирането на рака се ускорява чрез имуносупресия (4); обаче взаимодействието между имунните клетки и раковите клетки в контекста на метастази остава не напълно разбрано.

Рибозомната S6 киназа 2 (RSK2) е серин/треонин киназа с два каталитични домена и едновременната мутация на двете места за свързване на аденозин трифосфат (ATP) отменя киназната активност (5). Киназите от семейство RSK проявяват множество клетъчни функции, когато се активират от растежни фактори, пептидни хормони или невротрансмитери (6). Те могат да регулират генната експресия чрез фосфорилиране на транскрипционните фактори (7). И накрая, мутациите на RSK2 със загуба на функция при хора причиняват синдром на Coffin – Lowry (CLS), X-свързана форма на умствена изостаналост, свързана със забавена костна възраст, закъсняло затваряне на черепните фонтанели и нисък ръст (8 ⇓ –10) . Въпреки че семейството на протеини RSK е широко проучено, малко е известно относно тяхната роля в имунната система.

T-bet (кодиран от Tbx21) е специфичен за имунните клетки член от фамилията T-box на транскрипционни фактори (11). T-bet претърпява посттранслационни модификации на протеини и може да определи клетъчната съдба чрез упражняване на пряка стимулаторна или индиректна инхибиторна активност върху експресията на целевия ген (12). T-bet може директно да регулира и активира транскрипцията на гена Ifnγ (13). IFNγ се произвежда в CD4, CD8 и клетки с естествени убийци (NK) (14). В отговор на IFNγ, T-bet се индуцира и участва в ремоделирането на хроматина на гена Ifnγ и стабилизирането на IFNγ протеина (15). Сред многото фактори, продуцирани от Th1 и CD8 + Т клетки, IFNγ е най-значимият цитокин, с роля в предотвратяването и потискането на развитието на ракови заболявания (16). В допълнение, IFNγ, произведен в CD4 + и CD8 + Т клетки, играе важна роля в инхибирането и убиването на туморни клетки и възпрепятства растежа (17).

В това проучване демонстрирахме, че RSK2 фосфорилира T-bet и насърчава регулирането на T-bet на нивата на експресия на IFNγ mRNA. Освен това, нашите резултати показват, че RSK2 нокаутиращите (KO) мишки показват понижаване на регулацията на IFNγ и по-висок процент на метастази в черния дроб в рак на дебелото черво в сравнение с мишки от див тип (WT). Като цяло, тези открития предполагат, че T-bet се фосфорилира от RSK2 и че фосфорилирането на серини 498 и 502 от T-bet е необходимо за инхибиране на метастази и растеж на рак на дебелото черво чрез положителна регулация на RSK2/T-bet/IFNγ сигнализация.

Резултати

IFNγ спонтанно намалени нива в мононуклеарни клетки от периферна кръв от пациенти с рак на дебелото черво на различни етапи на заболяването.

IFNγ е критичен цитокин за имунитет срещу вирусни и бактериални инфекции, както и за наблюдение на тумори (17, 18). Взети са проби от кръв от периферната циркулация от пациенти с рак на дебелото черво на различни стадии на заболяването. Изолирани са мононуклеарни клетки от периферна кръв (PBMCs), включително 70–90% лимфоцити (т.е. Т-клетки, В-клетки и NK клетки) (19). PBMCs бяха стимулирани с форбол-12-миристат ацетат (РМА) и йономицин (20), нивата на RSK2 mRNA бяха анализирани с помощта на човешки праймери RSK2, а нивата на IFNγ бяха открити в супернатантни фракции с помощта на човешки IFNγ ELISA комплект. Резултатите показват по-ниски нива на експресия на mRNA на RSK2 при пациентите с рак на дебелото черво в сравнение с нормалните контролни субекти (Фиг. S1A). Освен това, нивата на IFNγ се понижават спонтанно, което съответства на напреднал стадий на заболяването (фиг. 1А). Нивата на серумен цитокин също са изследвани при пациенти с рак на дебелото черво и нормални, здрави контроли и не са наблюдавани значителни разлики (Фиг. S1 B-G). GM09621 и GM03317 са човешки лимфобластни клетъчни линии, които експресират RSK2 WT (RSK2 +) и RSK2 мутантни (RSK2 -) гени, съответно (7). Когато се стимулират с РМА и йономицин, RSK2 - лимфобластите показват намалени нива на IFNy mRNA в сравнение с RSK2 + лимфобластите (фиг. 1В).

Нивата на IFNγ в PBMC на пациенти с рак на дебелото черво от различни стадии. (A) PBMCs бяха стимулирани и IFNy секрецията беше открита с помощта на човешки IFNy ELISA комплект. (B) RSK2 - лимфобластите показват по-ниски нива на IFNγ mRNA в сравнение с RSK2 +. GM09621 (RSK2 +) и GM03317 (RSK2 -) бяха третирани с РМА и йономицин или нелекувани. Експресията на ген на Ifnγ се анализира чрез PCR. Gapdh служи като вътрешен контрол. (C) Анализ на популациите на IFNγ в далаците и лимфните възли на WT и RSK2 KO мишки. Средната флуоресцентна интензивност на експресията на IFNy се анализира чрез поточна цитометрия.

RSK2 KO мишки са генерирани за изучаване на мозъчната функция и размера на тялото. Тези мишки показват характеристики, съвместими с умствената изостаналост и намалените характеристики на растеж, наблюдавани при лица с CLS, които нямат функционални RSK2 протеини (21), и по този начин предоставят полезен модел за изучаване на функцията на RSK2. Известно е, че далакът и лимфните възли са важни за правилното функциониране на имунната система, действайки като филтри за чужди частици и ракови клетки. Първичните клетки, изолирани от далака на мишката и лимфните възли, се анализират чрез поточна цитометрия. Резултатите показаха, че CD4 +, CD8 + и NK клетъчни популации и техните нива на пролиферация не се различават значително между WT и RSK2 KO мишки (Фиг. S2); въпреки това, оцветената с IFNy + клетъчна популация в тези органи драстично е намалена при мишките RSK2 KO (фиг. 1С).

Степента на метастази в черния дроб на рак на дебелото черво е значително увеличена при мишките RSK2 KO.

IFNγ е критичен компонент на имунитета към метастатични карциноми (22) и нашите резултати показват, че дефицитът на RSK2 е свързан с намалена секреция на IFNγ (фиг. 1 B и C). Това наблюдение ни накара да изследваме дали изчерпването на RSK2 може да насърчи метастатичния растеж на рака. За да направим това, ние имплантирахме CT26 клетки на карцинома на дебелото черво, клетъчна линия на миши рак, широко използвана в проучвания за метастази, в далаците на WT и RSK2 KO мишки за 10–14 d (23). При некропсия установихме, че черният дроб на мишката RSK2 KO е напълно зает с ракови клетки в сравнение с WT мишки (фиг. 2А). Хистологичното изследване на чернодробни тъкани, оцветени с H & E, разкрива, че много големи участъци от черния дроб съдържат метастази (фиг. 2В, вляво).

Честотата на метастази в черния дроб на рак на дебелото черво е значително увеличена при RSK2 KO мишки. (А) Представителни снимки на метастази в далака и черния дроб (Mets) на WT и RSK2 KO мишки. (Б) Имунохистохимичен анализ на туморни тъкани. Туморните тъкани се оцветяват с H&E или PCNA антитяло. Броят на PCNA + оцветени клетки е значително по-висок в RSK2 KO групата в сравнение с WT групата. * P +, CD8 + и NK клетки като критични компоненти на имунитета срещу метастатичен растеж на тумори (24, 25). IFNγ се произвежда от CD4 + и CD8 + Т клетки и играе важна роля в инхибирането и убиването на туморни клетки, като по този начин възпрепятства растежа на тумора (17). Чернодробни клетки се събират от RSK2 KO и WT мишки и се анализират чрез поточна цитометрия. CD4 + и CD8 + клетъчните популации са значително по-високи при мишките RSK2 KO в сравнение с контролите на WT (фиг. S3A). Освен това, тъй като в дрениращите лимфни възли се развиват специфични за тумора ефекторни клетки (26), ние събрахме лимфни възли и далаци от мишки с метастази в черния дроб. Първичните клетки бяха изолирани и оцветени с IFNy/CD4, IFNy/CD49b (т.е. NK клетъчен маркер) или IFNy/CD8. Данните показват значително по-ниска експресия на IFNγ в CD4 +, NK и CD8 + клетки в RSK2 KO мишки в сравнение с WT мишки дори при CT26 усложнения, предизвикващи тумор на дебелото черво (Фиг. 3 и Фиг. S3B).

IFNγ се регулира надолу при RSK2 KO мишки. (A и B) Анализ на поточна цитометрия на процента на IFNγ/CD4 + клетки в първични клетки, изолирани от далаци (A) или лимфни възли (B) на WT и RSK2 KO мишки. (C и D) Анализ на поточна цитометрия на процента на IFNγ/CD49b + клетки от първични клетки, изолирани от далаци (C) или лимфни възли (D) на WT и RSK2 KO мишки (* P S498A/S502A) почти напълно премахва фосфорилирането от RSK2 (фиг. 4А, горна, лента 4).

RSK2 се свързва с и фосфорилира T-bet. (A) RSK2 фосфорилира T-bet при серини 498 и 502. His-T-bet див тип и мутант His-T-bet S498A/S502A слети протеини се подлагат на in vitro киназен анализ чрез активен RSK2. Резултатите се визуализират чрез авторадиография. (B) T-bet показа по-високо ниво на фосфорилиране в клетките RSK2 +. RSK2 + и RSK2 - не са били третирани или третирани с РМА и йономицин. След имунопреципитация с T-bet антитяло се открива фосфорилиран T-bet, използвайки p-сериново антитяло. Панелите представляват отделни петна. (C) Потвърждение на T-bet и RSK2 обвързване. Ендогенният RSK2 беше изтеглен с RSK2 антитяло и едновременно преципитиран T-bet беше открит в клетките Jurkat. Панелите представляват отделни петна. (D) Модел на свързване на N-терминален киназен домен на RSK2 с T-bet фрагмент (остатъци 490–510). RSK2 е показан като повърхностно представяне, а фрагментът T-bet е представен като представяне на кашон в червено. Уголеменият изглед показва двете места за фосфорилиране на T-bet, серини 498 и 502, представени в модел пръчка.

За да изследваме нивата на фосфорилиране ех vivo, стимулирахме клетки GM03317 (RSK2 +) и GM03317 (RSK2 -) с РМА и йономицин. Открихме значително по-високо ниво на фосфорилиране на T-bet в клетки GM09621 (RSK2 +) в сравнение с клетки GM03317 (RSK2 -) (фиг. 4В). За да изследваме взаимодействието на T-bet и RSK2, изтеглихме ендогенния RSK2 с RSK2 антитяло и също така открихме ендогенен T-bet в анализ на коимунопреципитация (Фиг. 4C). Тези резултати предоставят допълнително потвърждение, че RSK2 обвързва T-bet.

По-рано нашата лаборатория реши кристалната структура на N-терминалния домейн на RSK2 (29), което е критично за активирането надолу по веригата (6). Използвайки метод на изчислителна хомология, ние конструирахме T-bet фрагмент (остатъци 490–510), който включва серини 498 и 502. След скачване с терминала RSK2 N и провеждане на молекулярна динамика, моделът на свързване показа, че RSK2 ATP-свързващата кухина специфично разпознава местата на фосфорилиране, серини 498 и 502 (фиг. 4D). Въз основа на тези общи резултати заключаваме, че T-bet е цел за фосфорилиране на RSK2.

RSK2 насърчава T-Bet-медиирана IFNγ mRNA експресия.

T-bet свързва промоторната област Ifnγ и регулира експресията на IFNγ (13, 30). Използвайки Jurkat клетки, човешка Т-лимфоцитна клетъчна линия, открихме, че ектопичната свръхекспресия на T-bet може значително да насърчи експресията на IFNγ иРНК (Фиг. 5А). Също така установихме, че експресията на лентивирус на sh-RSK2 в тези клетки блокира експресията на протеин на RSK2 (фиг. 5B, вляво) и експресията на mRNA на IFNy е потисната в сравнение с трансфектираните с sh-mock клетки (фиг. 5B, вдясно). И накрая, за да изясним функцията на фосфорилирането на T-bet S498/S502, ние свръхекспресирахме T-bet див тип или мутант T-bet S498A/S502A (Фиг. 5C, вляво). Резултатите показват, че T-bet див тип може да бъде фосфорилиран от RSK2, докато мутантната форма на T-bet не може да бъде фосфорилирана (Фиг. 4А, линии 3 и 4). Както се очаква, мутантният T-bet S498A/S502A-промоцията на експресията на IFNy е драстично намален в сравнение с този на WT T-bet (Фиг. 5C, вдясно). Тези данни допълнително потвърждават, че RSK2 фосфорилирането на T-bet е необходимо за IFNγ експресия ex vivo.

Периферната кръв беше изтеглена от мишки за идентифициране на успешно възстановяване на реципиентни мишки. Данните показват, че sry (мъжки специфичен) ген (32) е открит във всички женски кръвни проби от получател на мишки (фиг. S4A). Използвахме тези RSK2 KO мишки с клетки на костен мозък, свръхекспресиращи макет, T-bet див тип или T-bet S498E/S502E като наш модел за изследване и имплантирахме CT26-луциферазна мишка колоректални ракови клетки в далака на всяка мишка. Както в предишно проучване на метастази в черния дроб (33), имплантираните клетки CT26-луцифераза бързо се размножават и заемат черния дроб на мишката (чрез инжектиране на далак) или белия дроб (чрез инжектиране на опашна вена) (34) in vivo. In vivo Ксеногеновото изображение (35), което измерва биолуминесценцията на CT26 клетките, разкрива, че започвайки на 7-ия ден след имплантация на тумор, са открити значително повече CT26 клетки в RSK2 KO мишки-трансфектирани мишки, отколкото в RSK2 KO T-bet див тип - или T-bet S498E/S502E - трансфектирани мишки (фиг. 7 A и B и фиг. S4 B и C). В допълнение, трансфектираните мишки с RSK2 KO T-bet S498E/S502E са имали значително по-малко метастази в CT26 в черния дроб и белите дробове в сравнение с трансфектираните мишки от див тип RSK2 KO T-bet (фиг. 7 A – C и фиг. S4 B – E).

Фосфорилирането на T-bet S498/S502 отслабва рака на дебелото черво метастази в черния дроб при мишки RSK2 KO. RSK2 KO мишки, свръхекспресиращи макет, T-bet див тип или T-bet S498E/S502E бяха установени чрез анализ на трансплантация на костен мозък. CT26 клетки (1 × 106), маркирани с луцифераза на светулка, се инжектират в далаците на тези мишки и се визуализира биолуминесценция на CT26 клетки, като се използва in vivo ксеногенно изображение в различни дни след имплантиране на тумор. (A) Показват се представителни изображения от всяка група (n = 5). (B) Данните бяха анализирани с помощта на софтуера Bruker MI SE. * P див тип - и T-bet S498E/S502E - трансфектирани групи. Интересното е, че нивата на IFNγ са били по-високи при мишките, трансферирани с T-bet S498E/S502E, отколкото при мишките, трансфектирани от T-bet от див тип (фиг. 7D). Тези данни показват, че неподходящото фосфорилиране на T-bet ускорява метастазирането и растежа на колоректалния тумор поради нарушен имунен отговор поради дефицит на RSK2.

Дискусия

Известно е, че неуспешният имунитет допринася за развитието и развитието на рака (36); по този начин, повишаването и поддържането на активирането на Т-клетките може да бъде ефективен подход при лечението на рак (37). Всички имуносупресивни лечения могат потенциално да влошат защитния капацитет на имунната система, което води до повишена честота на ракови заболявания (38). Въпреки че протеините от семейството на RSK са широко проучени за тяхното участие в множество клетъчни функции, малко е известно за тяхната роля (и) в имунната система in vivo. Както беше съобщено по-рано, RSK2 се активира каталитично от стимулация на Т-клетъчните рецептори (TCR) и играе съществена роля в активирането на Т-клетките. Т, В и NK клетки от RSK2 KO мишки се развиват нормално (27) и подобни наблюдения бяха направени в нашата вътрешна колония за размножаване на мишки RSK2 KO. Когато първичните клетки бяха изолирани от далаци и лимфни възли и оцветени за откриване на CD4, CD8 или NK клетъчен маркер, не бяха открити значителни разлики между WT и RSK2 KO групите (фиг. S2). Както Т, така и В клетките могат да разпознаят разнообразен набор от потенциални туморни антигени, а също така могат да открият малки антигенни разлики между нормални и трансформирани клетки (36). Нашите RSK2 KO мишки показаха значително повишен процент на метастази в черния дроб с предизвикателство за рак на дебелото черво (Фиг. 2А).

Всички горепосочени ефекти изглежда се дължат на неподходящото фосфорилиране на T-bet, което уврежда имунния отговор (фиг. 7 и фиг. S4); обаче как RSK2 подобрява антитуморните CD8 + Т-клетъчни отговори директно или индиректно чрез CD4 + Т клетки или друг механизъм изисква допълнително проучване. Клинично хетерогенните мутации на загуба на функция в гена hRSK2 (RPS6KA3) причиняват CLS и ~ 70–80% от диагностицираните пациенти нямат фамилна анамнеза (9). RSK2-нулева мишка е създадена като модел за CLS. Настоящите клинични проучвания на CLS са фокусирани главно върху пациенти със сериозно забавяне на развитието и степента на имунната недостатъчност остава неясна.

Като цяло, нашите резултати показват, че дефицитът на RSK2 може да доведе до драстично намалена секреция на IFNγ чрез неподходящо фосфорилиране на T-bet. Това може да доведе до имунна супресия, която ускорява метастазирането и растежа на рака на дебелото черво. Клиничното значение на тези находки изисква допълнително проучване. В допълнение, анализът на честотата на рака и имунната функция при пациенти с CLS може да предостави ценна информация.

Материали и методи

Образното изследване на мишки in vivo с ксеноген се извършва с помощта на системата Xtreme Imaging (CareStream Health) и биолуминесценцията се определя количествено, използвайки софтуер Bruker MI. Материалите и методите, използвани в това проучване, са подробно описани в SI Materials and Methods.

Благодарности

Благодарим на д-р Ребека Морис и Кели Джонсън за съдействието при теста за трансплантация на костен мозък, д-р. Dan Li, Xuejiao Liu, Haitao Li, Young Jin Jeon и Do Young Lim и Todd Schuster за подкрепящи експерименти; и д-р Тиа Рай и Ники Брикман за съдействие при изпращане на ръкописи. Тази работа беше подкрепена от Фондация Хормел; Национални здравни институти (безвъзмездни средства CA166001, CA172457, CA196639 и CA187027, на Zigang Dong) и Националната научна фондация на провинция Хенан, Китай (грант 162300410337).

Бележки под линия

↵ 1 K.Y., C.P., Yuwen Zhang и T.A.Z. допринесе еднакво за тази работа.

Принос на автора: K.Y., C.P., Ziming Dong, B.L. и Zigang Dong проектирани изследвания; K.Y., C.P., Yuwen Zhang, T.A.Z., M.-H.L., S.-Y.L., E.R., H.C., J.R., L.W., Yi Zhang, G.G., W.H., W.-Y.M. и K.L. извършени изследвания; K.Y., C.P., T.A.Z. и H.C. анализирани данни; и K.Y., A.M.B. и Zigang Dong написаха статията.

Авторите не декларират конфликт на интереси.